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- 2023-12-14 发布于未知
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无菌检验培养基最小检出量方法验证实验
·兽药典规定无菌检验用培养基灵敏性验证时接种相应质控菌菌落数为1-50CFU，这个范围较广，不能精确的验证培养基的灵敏性，故为了更精确的对培养基进行验证，确定其最小检出量，特进行此方法验证。
名称
质控菌
流乙醇酸盐培养基（TG）
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌
酪胨琼脂（GA）
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌
葡萄糖蛋白胨（GP）
白色念珠球菌、黑曲霉菌
材料：
名称
厂家
批号
名称
来源
批号
活菌数
规格
流乙醇酸盐培养基（TG）
中海生物
150420
金黄色葡萄球菌
自制
201301
9.5*105CFU/ml
0.5ml/支
酪胨琼脂（GA）
中海生物
151123
铜绿假单胞菌
自制
201301
8*106CFU/ml
0.5ml/支
葡萄糖蛋白胨（GP）
中海生物
151026
白色念珠球菌
自制
201301
1.6*104CFU/ml
0.5ml/支
蛋白胨
OXOID
869398
生孢梭菌
自制
201301
8*104CFU/ml
0.5ml/支
营养琼脂
中海生物
160229
/
/
/
/
/
/主要试剂配方
3.1硫乙醇酸盐（TG）培养基：取培养基30g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。
3.2酪胨琼脂（GA）培养基：取培养基42g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。
3.3葡萄糖蛋白胨（GP)培养基：取培养基28g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。
3.4半固体TG培养基：分别取TG培养基30g、GA培养基1g，加入1LMILLIPORE水，加热煮沸至完全溶解分装，116℃高压灭菌30min，于室温备用。
3.50.1%蛋白胨水：取1g胰蛋白胨，加入100mlMILLIPORE水，溶解后121℃灭菌15min，放置室温后，置2-8℃保存。
实验方法
4.1GA/TG培养基最小检出量实验
将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌用0.1%蛋白胨水还原后，分别按照表3进行稀释，取理论菌落数为1CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml、15CFU/0.2ml、20CFU/0.2ml的稀释度,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌每个稀释度分别接种TG、6支，每支0.2ml,3支置25℃培养箱，另3支置37℃培养箱分别培养7日，每天观察小管污染情况并记录；金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌接种GA斜面6支，每支0.2ml,3支置25℃培养箱，另3支置37℃培养箱分别培养7日，每天观察小管污染情况并记录。
同时金黄色葡萄球菌每个稀释度接种2副营养琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培养。
铜绿假单胞菌每个稀释度接种2副酪胨琼脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培养。
生孢梭菌每个稀释度接种2管半固体TG培养基，每管0.2ml菌液,置37℃培养。
TG/GA小管配制日期：2016.03.21
接种日期：2016.03.23
表3铜绿假单胞菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌最小检出量验证稀释方法
铜绿假单胞菌
管号
原瓶
①
②
③
④
⑤
⑥
⑦
⑧
⑨
10
11
稀释液ml
1ml
4.5
9
9
9
9
7.4
6
7
5
6
加样量
/
取原瓶0.5
取①1
取②1
取③1
取④1
取⑤4
取④2
取⑤
取④1
取⑤2.5
取⑥1
CFU/ml
4*106
4*105
4*104
4*103
400（计数）
75（计数）
35（计数）
100
75
50
25
5
CFU/0.2ml
/
/
/
/
/
/
/
20
15
10
5
1
生孢梭菌
管号
原瓶
①
②
③
④
⑤
⑥
⑦
⑧
⑨
/
/
稀释液ml
1ml
4.5
9
9
9
3
4.3
7
2.4
4
/
/
加样量
/
取原瓶0.5
取①1
取②1
取③1
取②1
取②1
取②1
取③4
取⑧1
/
/
CFU/ml
4*104
4*103
400
40
4
100
75
50
25
5
/
/
CFU/0.2ml
/
/
/
/
/
20
16
10
5
1
/
/
金黄色葡萄球菌
管号
原瓶
①
②
③
④
⑤
⑥
⑦
⑧
⑨
/
/
稀释液ml
1ml
4.5
4.5
4.5
3.75
5.2
4.25
4.25
2
4.5
/
/
加样量
/
取原瓶0.5
取①0.5
取②0.5
取③1
取③1
取③0.5
取③0.5
取⑦2
取⑦0.5
/
/
CFU/ml
4.75*105
4.75*104
4.75*103
4.75*10
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