苯酚硫酸法测总糖.docxVIP

苯酚-硫酸法

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

［试剂］

6%苯酚：

先配置80%苯酚：80g苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

再配置6%苯酚：取75ul的80%苯酚于烧杯中，加入960ul水（每次测定均需现配），测定的时候就用6%的苯酚来测！

浓硫酸

［操作］

制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

样品含量测定：

吸取2.0ml样品然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置30分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。

可能有以下问题需要注意：

1。苯酚是否重蒸、其溶液浓度、是否现配现用

2。 加入硫酸后是否加热、显色时间的确定

3。 阁下所选波长：这个最为重要，因为已糖及其甲基化衍生物在490nm下有最大吸收峰，而戊糖、糠醛酸及其甲基化衍生物在480nm下有最大吸收峰。如果阁下的多糖样品不是单一品而是数种混合（纯化也难一达到100%纯），则波长一定要扫描过再做

4。 加浓硫酸前要摇匀，加之后也要摇匀。

苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

理 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。

试剂

1.浓硫酸：分析纯，95.5%

2.80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，

可置冰箱中避光长期储存。

6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配）

.标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia），或分析纯葡萄糖。

.15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可

置冰箱中长期储存。

.5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可

置冰箱中长期储存。

.6mol/L氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

.6mol/L盐酸

操作

制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml,然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

样品含量测定：

取样品1克（湿样）加1ml15%TCA溶液研磨，再加少许5%TCA

溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。 注意：总的溶液不

要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。

离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上消液时应过滤?因为其脂肪含量大容易

夹带残渣）

水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀，在96°C水浴锅中水浴2小时。

定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml,