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高级生物与分子生物学

实验报告

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指导老师:

实验一：重组pGEX-X载体的构建及表达

【实验原理】：

DNA连接原理：本实验将表达载体和PCR产物X进行双酶切，经琼脂糖凝胶后，割胶分离纯化的目的基因和线性化质粒，用T4DNA连接酶连接表达融合蛋白的重组质粒。

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：经氯化钙处理的大肠杆菌，受短暂的热刺激后，可形成易于接受环状质粒DNA的感受态细胞。由于不同的质粒可带有不同的抗生素抗性基因(本实验质粒带有卡那霉素抗性基因)，根据转化菌的耐药特性进行删选。

裂解法小量制备质粒DNA的原理：SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存在于上清液中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。

重组质粒鉴定的原理：对所有的重组质粒用限制性内切酶酶切，酶切产物行凝胶电泳以鉴定质粒DNA。

组质粒的诱导表达的原理：Ptac启动子受lac阻遏物所调控，该启动子需要加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTP)进行诱导°IPTP的终浓度为1mmol/Lo

融合蛋白的表达检测的原理：经诱导表达的重组体裂解后，经SDS鉴定。染色后明显出现目的蛋白带，而未经诱导的菌无

此蛋白带。

【实验步骤】：

配制LB和LK培养基

连接：质粒片断+目的基因（1.5m1离心管），16°C水浴过夜，