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茯苓倍性与基因组大小的测定

椰子是中国传统的常见菌，也被称为松鸡和甘薯。根据《中华人民共和国药典》2010年版的《椰子》，来源于多孔科和假单胞菌（schw.）wolf干燥菌核。野生茯苓多分布于北纬18°~37°、东经98°~121°之间的亚热带、热带,其作为经济型真菌在我国已有2000多年的栽培历史。茯苓作为传统中药应用已久,具有利水渗湿,健脾宁心等功效,《神农本草经》将其列为上品。现代药理学研究表明,茯苓具有抑制肿瘤、抗炎、调节免疫等作用,具有广阔的开发前景。

自1996年第一个真菌酿酒酵母基因组测序完成后,70余种真菌基因组测序工作已经组装完成或正在组装。真菌的全基因组信息可推动其分子水平研究的深入开展,有助于人们了解真菌的生理特性、进化和代谢多样性。目前,已测序真菌大部分集中于重要的人类病原菌、植物病原菌、腐生菌或者模式生物,药用真菌范围尚属空白。药用真菌在我国资源丰富,有临床药用基础的真菌近300种,近年来建立的DNA条形码鉴定系统,对药用植物和药用真菌的正确鉴定提供了强有力的工具[7~9]。本研究以茯苓作为药用真菌基因组学研究的开端,对其基因组大小测定方法进行探索。

测定基因组大小可估测物种的DNA含量,对于待测物种的选择及测序工作前期预算的评估具有指导意义,为基因组测序提供了不可或缺的基础数据。流式细胞仪可在高速液流中对DNA含量进行测定分析,检测器捕捉单细胞悬浮液中经DNA特异性染料染色的细胞核被激发后所发射的荧光信号,并用直方图进行量化分析,通过与内参比较相对荧光强度从而计算出DNA含量。流式分析技术已经被广泛地应用于植物、真菌的基因组大小测定,制样方法简便易行,检测结果较为稳定可靠。

本研究利用茯苓为待测对象,选取黑曲霉作内标,用流式细胞仪对6组样品进行重复实验,通过比较计算测定了茯苓基因组的大小,为其基因组学研究提供了基础数据。本研究还对药用真菌基因组大小测定进行了方法学上的探索,建立了流式细胞仪测定药用真菌基因组大小的平台,以期更为准确、快速地测定其它药用真菌。

一、材料表面

1.柠檬酸siga-aldr吾,teen-20,kn

碘化丙啶(Sigma-Aldrich,cat.no.P4170);RNase(Sigma-Aldrich,cat.no.R5000);柠檬酸(Sigma-Aldrich,cat.no.C2404-100G);Tween-20(Sigma-Aldrich,cat.no.P2287);磷酸氢二钠(Sigma-Aldrich,cat.no.S7907,99.0%);300目尼龙筛网(北京利文商贸有限公司)

2.实验仪器

流式细胞仪BDFACSCalibur(BDBioscienceCorporation),ThermoScientificSorvallLegendMicro17R微量台式离心机(ThermoScientific),SHP-80生化培养箱(北京利康达圣科技发展有限公司),THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器(太仓市实验设备厂)。

3.试验中的蘑菇

实验所用茯苓和黑曲霉菌株均由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供。

4.自然ph值的测定

PDA培养基:马铃薯200g(煮沸后过滤取滤液)、琼脂20.0g、葡萄糖20.0g、MgSO4·7H2O1.5g,KH2PO43.0g,维生素B22.0mg,加水定容至1000mL,自然pH值。

二、方法

1.茯苓培养材料

茯苓和黑曲霉菌种活化后接种在PDA平面培养基上,28℃下培养至茯苓菌丝覆盖整个平皿4/5时或黑曲霉产生肉眼可见的黑色分生孢子层,在40mL新PDA液体培养基上接种0.5cm2左右大小的带有菌丝的琼脂块,以温度为28℃、转速为150rpm的条件对茯苓进行培养4d、黑曲霉培养2d。

2.茯苓离心液制备

本研究细胞核悬液的制备方法参考Jaroslav等。称取洗净培养基的茯苓菌丝团150mg置冰浴培养皿中,移取2mLOttoI溶液(0.1M柠檬酸,0.5%(v/v)Tween20,0.22μm水系微孔过滤膜过滤,4℃保存备用),使培养皿倾斜放置以避免溶液挥发,用锋利刀片迅速将菌丝团切碎;用1mL移液枪反复搅拌已切好的茯苓菌丝团混合液使其混合均匀,吸取样品并经300目尼龙筛网过滤,滤液置入1.5mL离心管中;所得滤液在4℃离心机中以8000×g离心5min;用1mL移液枪移去上清,将离心管倒置在纸上使剩余液体自然流干,加入100μL冰浴OttoⅠ溶液,轻摇离心管使样品混合均匀,放置冰上待用;进行流式细胞术分析前,向样品中加入800μLOttoⅡ溶液(0.4MNa2HPO4-12H2O,0.22μm水系微孔过滤膜过滤,室温(18~25℃)保存备用)。

3.流式细胞仪