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du728在水稻叶片定殖中的传导作用

在特定的生态环境中引入生态菌后，生态菌的抗殖能力和植物体内的传统能力是影响其抗殖效果的重要因素。Du728是本实验室通过基因缺失和标记置换方法构建的稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)毒性基因缺失突变体。作者在过去的工作中已明确了毒性基因突变体Du728对水稻白叶枯病的防治效果,但对其在水稻上的定殖能力和在植株内的传导情况尚不清楚。本文研究了Du728在水稻幼苗上的定殖和传导情况,以期为生防菌的应用及其作用机制研究提供基础理论。

1材料和方法

1.1菌株的培养

供试水稻品种为汕优63,按常规方法准备稻苗。将Du728在NB培养液中培养48小时后,离心,用无菌水洗脱菌体后稀释至104cfu/ml。取0.1ml菌液涂于平板,以15W紫外灯距离25cm左右照射5分钟(以95%菌体死亡为最佳处理时间)。处理的平板培养48～72小时后,挑取单菌落接种至NB培养液中,振荡培养12小时后加入100μg/ml利福平,继续培养72小时后取0.1ml菌液涂布于含200μg/ml利福平的NA平板上培养48小时。形成的菌落即为Du728抗利福平标记菌株(Du728Rif,浓度为5×109cfu/ml)。

1.2决策权：水稻叶片和伤口的定殖和细菌数量

1.2.1叶片的采样分离

在培养2天的Du728Rif菌液中加入0.1%吐温-20后,喷雾处理汕优63幼苗(4叶1心)。喷雾后10分钟内立即采样分离(作为初始菌量),以后隔日从处理叶片内分离回收Du728。同时,在喷雾处理2天后,从叶片不同部位切取5mm×5mm的小块,用双面胶带直接固定在样品台上,2%锇酸熏蒸固定2天,自然干燥后直接喷金,在日立扫描电镜下观察。

1.2.2初始菌量的确定

用剪刀沾取上述菌液剪叶接种20张叶片,剪叶后10分钟内立即取剪口向下2cm长的部分进行分离(作为初始菌量)。以后隔日从接种叶片(剪口向下2cm长的部分)内分离回收Du728。

1.3陈728水稻植物的传统变量

1.3.1制备菌种5.7%

将汕优63种子表面消毒后按常规方法浸种至露白时,用Du728Rif菌液(200μg/ml)拌种(2ml/g干种),在28℃温箱内放置24小时后播于灭菌的培养皿内。长出幼芽后隔日在含利福平的平板上分离回收Du728。

1.3.2浸根回收粗

从盆钵中拔出4叶1心期的汕优63幼苗(根部受伤),用Du728Rif菌液浸根处理,分别在浸根1、4、8和12小时后从根部和地上部第四叶中分离回收Du728。12小时后将处理的幼苗移栽盆钵,移栽后逐日从根部和顶部第四叶中分离回收Du728。

1.3.3叶片的分离

用Du728Rif菌液喷雾处理汕优63幼苗(4叶1心)的下部3张叶片或剪叶接种第三叶,处理后隔日从未处理(第四叶)的叶片内分离回收Du728。

2结果与分析

2.1细菌细胞分布

叶面喷雾后2天采样。扫描电镜观察表明,水稻叶片正面边缘各有一排排列较为紧密的水孔,一直到达叶尖,水孔向内是分散的气孔。水孔与气孔较为相似,都有一对保卫细胞,但气孔保护细胞较为突起,有蜡质覆盖,4个乳突位于中部;而水孔表面无蜡质,4个乳突较小并位于孔腔顶端。Du728在水稻叶面上形成一定种群数量后,细菌细胞微观分布极不均匀,大多数聚集在水孔周围(图1),而在气孔部位未见细菌细胞的聚集(图2)。此外,由于喷雾和制样过程中对叶表造成许多微伤口,特别是叶面倒伏的刚毛基部伤口处也常有部分细菌细胞的聚集。显然,Du728在叶面上定殖的部位与其野生型菌株JXOⅢ相同。

2.2不同菌株菌量的变化

用Du728喷雾处理稻苗或剪叶接种后,处理叶片及伤口处Du728的菌量消长动态表明(图3),Du728可以在叶面和伤口处定殖。叶片喷雾处理后,Du728在叶面上的初始菌量为1.6×103cfu/g·FW(克鲜重);处理后1天内为适应期,菌量下降至2.3×102cfu/g·FW。以后Du728开始繁殖,至第5天,叶片中菌量达到最高,为1.7×104cfu/g·FW;5天后叶片中的菌量逐渐减少,15天以后叶片中回收不到Du728。在剪叶接种的伤口处,Du728的初起菌量为7.4×103cfu/g·FW,接种后1天菌量下降至2.2×103cfu/g·FW。至第三天伤口菌量达到最高,为1.0×104cfu/g·FW;3天后叶片中的菌量逐渐减少,11天以后叶片中回收不到Du728。

2.3陈728水稻植物的传统变量

2.3.1幼苗分离回收

抗利福平的Du728菌液拌种,出芽后隔日从幼苗的各部位分离回收Du728。结果表明:经连续6次分离都未能从幼根、芽(叶)中分离到Du728。

2.3.2稻苗深部菌株du联

将水稻幼苗受伤的根浸在Du728菌液中,