细胞因子的检测和应用详解演示文稿.pptVIP

本文档共41页；当前第1页；编辑于星期日\22点20分优选细胞因子的检测和应用本文档共41页；当前第2页；编辑于星期日\22点20分概述概念细胞因子（cytokine）是指由活化的免疫细胞（包括淋巴细胞和非淋巴细胞）和某些基质细胞分泌的、介导和调节免疫应答及炎症反应的小分子多肽类因子，它们是除免疫球蛋白和补体之外的另一类非特异性免疫效应物质。产生细胞因子的细胞种类很多，但归纳起来主要有三类：①活化的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核／巨噬细胞、大颗粒淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞等；②基质细胞类，包括骨髓和胸腺的基质细胞、内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、中枢神经系统的小胶质细胞等；③某些肿瘤细胞系。产生：抗原、致分裂原、感染、炎症等多种因素可刺激细胞因子的产生，各细胞因子之间也有相互刺激合成和分泌的作用。本文档共41页；当前第3页；编辑于星期日\22点20分共同特点1)正常休止状态的细胞必须经刺激和活化后才能合成和分泌CKs,细胞内无细胞因子前体储存,接受刺激后从激活基因开始至合成,分泌,刺激结束后细胞因子的产生随即停止.。2）绝大多数CKs均为低分子量（4～80kD）的糖蛋白。3）分泌特性：大多数的CKs是通过旁分泌（paracrine），或自分泌（autocrine），少部分通过内分泌的形式作用于远处靶细胞或靶器官；4）多样性：一种细胞可产生多种细胞因子，不同类型细胞也可产生一种或几种相同的细胞因子。5）网络性：协同效应；重叠效应；拮抗效应。6）高效性：它们的受体亲和力高，表现很强的生物学活性，是免疫球蛋白等分子远不能及的。7)非特异性:细胞因子多由免疫细胞在特定抗原或丝裂原刺激下所产生,但其对靶细胞发挥功能却为非特异性,也不受MHC限制.本文档共41页；当前第4页；编辑于星期日\22点20分3．分类白细胞介素（interferon）IL干扰素（interferon）IFN肿瘤坏死因子（TNF）集落刺激因子（CSF）生长因子（growfactor）GF趋化因子本文档共41页；当前第5页；编辑于星期日\22点20分细胞因子检测受体检测技术生物学细胞增殖靶细胞杀伤趋化活性诱导产物细胞病变抑制分子生物学DNARNA检测ELISA免疫学流式细胞技术本文档共41页；当前第6页；编辑于星期日\22点20分生物学检测法

(1)细胞增殖法依赖细胞株：许多细胞因子具有细胞生长因子活性，利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可在体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量成正比。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种因子活性。本文档共41页；当前第7页；编辑于星期日\22点20分3H-TdR掺入法原理：将3H-TdR作为DNA合成的原料掺入到新增殖的细胞中，细胞DNA合成的增加或减少而间接判断细胞增殖的方法，而用放射物质标记的胸腺嘧啶则可代表细胞DNA的增值程度，通过与细胞因子标准品比较，而推算出待测标本中细胞因子的含量。本文档共41页；当前第8页；编辑于星期日\22点20分步骤：1．依赖细胞株的培养。用血细胞计数仪测定细胞密度，取适当体积的细胞用于测定。用基础培养液洗细胞两次后，测定细胞活力（应80%），并以测定培养液重悬细胞至合适终浓度用以测定。表１５－１提供了参考。２．用细胞因子标准品建立一个标准曲线，并设置已知含测定培养液的质控孔。３．适当稀释待测标本，加入微孔板中双份重复测定。４．每孔中加入细胞悬液，置于湿润的CO2培养箱中３７℃培养。（培养时间按所用细胞株而定）５．加入3H标记的胸腺嘧啶，在置于CO2培养箱中３７℃培养约4h。６．收集细胞于玻璃纤维滤纸上，是用液体闪烁仪测定放射活性。此方法优点是易于自动化，测定的信噪比最好，可常规用于大标本量的测定。缺点是使用放射性核素，试验废物处理麻烦。本文档共41页；当前第9页；编辑于星期日\22点20分MTT法

MTT（四唑盐）比色法是一种检测细胞存活和增殖的方法，所用的显色剂是一种能接受氢原子的化合物MTT。原理是，活细胞内线粒体琥珀