茯苓多糖抗肿瘤效应与凋亡相关基因蛋白fas、bcl-2和bax的关系.docxVIP

茯苓多糖抗肿瘤效应与凋亡相关基因蛋白fas、bcl-2和bax的关系

许多动物实验证明，椰子糖（pps）对人体和外部有显著的肿瘤作用。但是,茯苓多糖抗肿瘤的确切作用机制目前尚不是很清楚。有人认为茯苓多糖通过增强机体的免疫力而对肿瘤细胞起杀灭作用。也有人认为茯苓多糖通过促进肿瘤细胞凋亡而对肿瘤细胞起杀灭作用。硫酸酯化的茯苓多糖是由武汉大学化学与分子科学学院张俐娜教授领导的课题小组从茯苓的菌丝体中提取多糖经硫酸酯化而首次获得的。笔者运用硫酸酯化的茯苓多糖进行动物实验时,在HE染色的肿瘤细胞中观察到“核染色质浓缩、边聚,甚至呈半月形”等细胞凋亡的现象。本实验在上述实验的基础上,通过免疫组织化学的方法对硫酸酯化的茯苓多糖促进肿瘤细胞的凋亡作了进一步的研究。

1材料和方法

1.1小鼠茯苓多糖水平的检测

Sarcoma180(S-180)肿瘤细胞(5×106/只)接种于7-8周的BALB/c小鼠的背部皮下,然后随机分为茯苓多糖实验组和PBS缓冲溶液阴性对照组,每组10只。进行腹腔注射,连续注射7d。于第9天处死小鼠取出肿瘤组织。

1.2单克隆抗体法sp

石蜡切片,切片厚4μm,经常规脱蜡水化后,用免疫组织化学SP法测定实验动物肿瘤组织中Fas、Bcl-2和Bax基因蛋白的表达水平。Fas、Bcl-2和Bax单克隆抗体(SantaCruz,USA)工作浓度为1∶100。SP试剂盒购自北京中山生物技术公司。阳性对照为已知阳性片,阴性对照以PBS代替一抗,具体操作方法参照SP免疫组织化学试剂盒说明书。镜下观察Bcl-2和Bax标本,细胞质或核膜上有棕色颗粒者为阳性细胞;观察Fas标本、细胞膜或细胞质有棕色颗粒者为阳性细胞。每张切片上选择10个具有代表性的高倍视野(×400),计数阳性细胞数和阴性细胞数,并计算阳性率[阳性率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%]。

1.3统计方法

采用SPSS11.0统计软件处理数据,样本率的比较采用χ2检验。检验水准α为0.05。

2pbs和茯苓多糖对pahs表达的影响

免疫组织化学染色显示,PBS阴性对照组肿瘤细胞多无Fas表达,极少数细胞有弱阳性表达;茯苓多糖实验组大多数肿瘤细胞的胞质和胞膜均有Fas蛋白强阳性表达,呈棕黄色颗粒,多为灶状分布或单个细胞散在分布(见插页2图1)。Bcl-2蛋白在PBS阴性对照组较多肿瘤细胞的胞质和核膜呈强阳性表达,阳性细胞多呈灶状分布,少数细胞呈散在分布;而茯苓多糖实验组只有少数细胞质和核膜有Bcl-2蛋白阳性表达,且阳性细胞多散在分布(见插页2图2)。PBS阴性对照组肿瘤细胞多无Bax表达,极少数细胞有弱阳性表达;而茯苓多糖实验组很多肿瘤细胞质和核膜有Bax蛋白强阳性表达,呈棕黄色颗粒状,多为灶状或单个细胞散在分布(见插页2图3)。实验组Fas阳性率为64.99%,阴性对照组阳性率为4.12%,两组间差异有显著性(P0.01);实验组Bcl-2阳性率为17.97%,阴性对照组阳性率为47.96%,两组间差异有显著性(P0.01);实验组Bax阳性率为48.05%,阴性对照组阳性率为2.45%,两组间差异有显著性(P0.01)。

3活性成分检测细胞凋亡和活性化合物的活性

细胞凋亡存在于机体的发生、发展的各个阶段。与细胞的增殖和分化一样,细胞凋亡对于维持机体组织自身的稳定具有十分重要的意义。机体组织自身稳定的前提是细胞增殖和细胞凋亡维持一个动态平衡。一旦这种平衡被打破,细胞增殖超过细胞凋亡,肿瘤即会发生。而对于肿瘤来说,如果细胞凋亡超过细胞增殖,肿瘤就会被抑制。

Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病基因2(B-Celllymphoma/leukemia2),是一种凋亡调控基因,它对细胞凋亡起抑制作用。它能在细胞周期的任一阶段抑制细胞凋亡,延长细胞生存期,引发肿瘤的产生。Bcl-2可能通过其表达产物Bcl-2与Bax形成异二聚体复合物来终止细胞凋亡的发生。Bcl-2不仅与Bax形成异二聚体复合物,还可形成同源二聚体复合物。Bax为Bcl-2家族成员,它也是一种凋亡调控基因。其表达并不阻断凋亡,而是具有对抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。虽然Bax也形成同源二聚体,但是反而加速了细胞凋亡的发生。Bcl-2功能的发挥决定于其与Bax的化学计量。这种方式可能有效地调节细胞对细胞凋亡的敏感性。带少量Bax的细胞只需低水平的Bcl-2即可达到形成Bcl-2-Bax的严格化学剂量,从而终止细胞凋亡的发生,相反,若Bax水平较高,可能形成较多的Bax同源二聚体复合物,从而加速细胞凋亡的发生。本实验的结果表明,