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法医dna检验中的难检材检验

pcr-str复合扩展技术已成为一种传统的法医方法，在在实践中发挥着重要作用。但是在大量应用这些技术进行检验的过程中也存在现有检测条件无法很好解决的问题,如绳索、弹壳、面罩、混合精斑等微量、降解、混合检材的检测,而且随着犯罪分子作案手段的不断提高,此类检材在犯罪现场出现的情况也日益增多。

通常情况下,使用常规检验技术难以得到理想实验结果的生物检材,主要包括降解生物检材、微量检材、混合生物检材3大类。

1检材降解后str分型是否能够检测

生命体停止正常的新陈代谢后如果长期暴露于外界环境下,则可能由于光照、湿度变化以及微生物等各种物理、化学、生物作用而发生细胞的降解。随着犯罪手段的不断提高,人为导致生物检材降解的案例更是屡见不鲜,例如河底沉尸、掩埋、化学试剂浸泡等,这给一线的DNA检验工作带来了巨大的挑战。影响生物检材降解的因素主要有3个方面:(1)温度。温度是影响生物降解最重要的因素。从化学降解的角度来说,温度每降低20℃,生物大分子的降解速率降低10~25倍,此外低温亦可降低生物降解的速度。(2)湿度。游离态水分子的存在将直接促使DNA分子降解,而极度干燥亦有可能造成DNA分子结构发生改变。(3)核酸酶、土壤微生物、强酸、强碱和紫外辐射等因素,也可造成DNA分子的降解。

由于生物检材降解后,DNA分子随机降解成小片段,使STR基因座无法检出,从而导致基因信息的缺失。使用常规的STR分型方法分析降解的高分子DNA仅仅能得到部分分型结果或是重复性较差的分型结果,图谱常见有类似ladder带、stutter带、等位基因不平衡扩增、位点丢失乃至无结果等现象,给鉴定工作带来了一定的困难。近年来,针对这一问题的解决措施主要有以下5个:

(1)利用其他检验系统来进行样本状况的判别。例如当扩增mtDNA200bp困难时,说明检材已经降解到200bp以下,就不应再过分追求STR分型敏感性而造成的分型异常。

(2)改变原有实验条件。影响扩增的实验条件包括体系、扩增循环数、温度等。在实际工作中可通过增加模板DNA的量、增加Taq酶的量、增大循环次数等方法来提高实验的成功率。但是PCR反应受到多种因素的影响,有些不明抑制物用现有的纯化方法不一定能去除,若增大模板量反而不利于提高扩增效果。此外,提高循环次数也容易导致某些基因座的非特异性扩增出现“假峰”。

(3)mini-STR技术。该技术是可作为解决降解生物检材问题的一个新方向,且已在我国众多基层实验室普及使用。其原理是重新设计引物,使其尽可能靠近STR核心重复序列的侧翼序列,将PCR扩增产物片段长度缩短至100bp左右,就可以大大提高微量和降解DNA的检出率。Tsukada等通过用DNA酶Ⅰ降解完整DNA的方法制作DNA降解模型,与商业试剂盒进行对比发现,随着DNA的降解,部分大片段位点出现等位基因丢失,而应用mini检测体系则得到了满意的分型结果。但是该方法也有需要改进的地方,例如CODIS系统中的某些核心位点不能用该方法来解决,缺少各人群的应用验证等。所以,目前mini-STR检测体系多作为一种补充检测方法使用。

(4)利用SNP多态性基因座进行分型。由于SNP基因座的PCR片段可以减少到60~80bp,并且SNP的分析方法较多,也不会出现STR基因座因聚合酶的滑脱产生的影子带和互补扩增产生ladder带的问题,这些优点使得该方法成为法医DNA学新的研究热点。

(5)mtDNA检测。利用线粒体高变区来进行分析,但对于许多法庭科学实验室来说,mtDNA的检测不仅费力而且成本较高,另外mtDNA是单倍体母系遗传,个人识别力远低于STR,mtDNA检测结果只能排除,不能认定。

2检测细胞的研究进展

低拷贝模板(lowcopynumber,LCN)DNA是指DNA含量少于100pg,相当于15个双倍体或30个单倍体细胞的生物样本。随着犯罪嫌疑人的自我保护意识不断增强,作案时遗留在现场的生物检材不断减少。在现场勘验中越来越重视微量物证,这给基层DNA检验带来了巨大的挑战。据统计,成都市公安局2007—2010年受理的微量检材数(烟头不计入)占检材总数的比例分别为7.3%、6.5%、9.6%和14.2%,呈明显的逐年递增趋势,2011年1至6月份该比例已高达18.6%。

LCN检材的来源常见的有以下几类:衣物(包括领口、腋下、帽子内缘、头套、内衣裤等)、作案工具(包括刀柄、撬门破墙工具、绳索、各种电动工具如切割机的操作手柄等)、与人体接触的日常用品(包括瓶口、筷子、牙刷、水果核、吃剩的馒头等)、其他(如强奸案中的乳头拭子、交通肇事逃逸案件中嫌疑车辆方向盘、换挡杆拭子等)。此外,根据分类不同,有些实验室也将烟头、指甲内遗留细胞归为脱落细胞。针对LCN