柑橘黄龙病菌实时荧光定量PCR检测技术规程.pdfVIP

柑橘黄龙病菌定量PCR检测技术

1范围

本文件规定了柑橘黄龙病病原韧皮部杆菌亚洲种（CandidatusLiberibacterasiaticus）实时荧

光PCR检测的样品制备、检测操作方法和结果判定标准。

本文件适用于对芸香科和非芸香科罹病植株和传病媒介柑橘木虱中韧皮部杆菌亚洲种的检测和病

害鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB5040柑桔苗木产地检疫规程

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB/T35333柑桔黄龙病监测规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

柑橘黄龙病CitrusHuanglongbing

一种由韧皮部杆菌引起的植物检疫性病害。主要侵染柑橘属、金柑属和枳属等柑橘类植株。由带菌

种苗远距离传播，田间主要由柑橘木虱取食传播。典型受害植株叶片斑驳不均匀黄化，枝梢黄化，果实

畸形，种子败育，严重时可引起植株死亡。

3.2

实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR

实时荧光聚合酶链式反应，一种在体外扩增微量的特殊DNA片段的方法，在扩增过程中由于荧光物

质的释放或荧光物质与扩增产物结合并被实时检测而能够快速、灵敏地检出模板DNA的存在。

3.3

扩增引物primer

人工合成的寡核苷酸序列，其序列与待扩增的目标DNA序列中的一段相同，用于引导DNA体外扩增。

3.4

扩增模板templet

DNA体外扩增中所用的待扩增的靶标序列。

3.5

Ct值cyclethresholdvalue

PCR

实时荧光反应中每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

4柑橘黄龙病基本信息

学名：韧皮部杆菌亚洲种CandidatusLiberibacterasiaticus。

病害名称：柑橘黄龙病，常用英文名：CitrusHuanglongbing。

分类地位：α-变形菌纲、根瘤菌目（Rhizobiales），根瘤菌科（Rhizobiaceae），韧皮部杆菌属

Liberibacter的革兰氏阴性细菌。是一种难培养细菌。

2

引起柑橘黄龙病的韧皮部杆菌根据其核糖体基因序列的差异可以分为3种，即分布于非洲的韧皮部

杆菌非洲种CandidatusLiberibacterafricanus，分布于南美洲的韧皮部杆菌美洲种Candidatus

Liberibacteramericanus和分布于亚洲及美洲的韧皮部杆菌亚洲种CandidatusLiberibacter

asiaticus(Jagoueixetal)。

柑橘黄龙病菌其他信息参见附录A。

本标准规定了对韧皮部杆菌亚洲种的检疫鉴定方法。对来自于非洲的柑橘材料的检疫检验，可参见

附录B检测韧皮部杆菌非洲种，对来自美洲的柑橘材料，除利用本标准检测韧皮部杆菌亚洲种外，可参

见附录C检测韧皮部杆菌美洲种。

5方法原理

本标准采用的实时荧光PCR检测包括了荧光染料法和荧光探针法两种检测方法。其原理是，利用

病菌特有DNA序列设计引物，在PCR扩增时加入荧光染料，荧光染料与扩增形成的产物-DNA双链结

合而发出荧光被检测器实时检测（荧光染料法)，或在合成特异性引物的同时合成一条特异性的荧光双

标记探针，探针5’端和3’端分别标记荧光素报告基团和猝灭基团，如果反应体系中存在待测目标DNA

模板，引物和探针则与模板上的序列配对而特异性结合，当PCR扩增延伸到探针结合部位时，TaqDNA

聚合酶将探针水解成单核苷酸，使标记在探针上的报告基团游离出来并发出荧光信号被检测器实时检测

（荧光探针法）。由于初始模板量的不同，反应管内的荧光物质达到设定的可检测阀值时所经历的Ct值

不同，因此Ct值可以用于判定检测样品的初始菌量。

6实验室设置

参照GB/T19495.2。实验室应至少分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应试剂配制区

和检测区；每个工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。

7主要仪器设备和试剂

7.1仪器设备

7.1.1实时荧光PCR仪。

7.1.