单基因遗传病的研究方法与技术.pptVIP

引物(Primers)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度化学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则第26页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三设计引物的原则：二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补长度为18~25个核苷酸二条引物之间避免形成引物二聚体引物的碱基组成应平衡引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）第27页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三DNA聚合酶TaqDNA聚合酶复制的保真性：TaqDNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。TaqDNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。第28页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三扩增失败试剂错加或漏加实验中如发现对照样本也扩增失败，可用原试剂重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。试剂失效变性温度偏低有些DNA所含G、C碱基对丰富，当变性温度偏低时，双链DNA不能完全解链。退火温度偏高第29页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三标本中DNA含量过高或杂质过多。降低加样量拖尾可明显改善。Taq酶加量过大或扩增循环数太多拖尾第30页，