内毒素实验凝胶法.pptVIP

凝胶法的试验步骤下面我们结合中国药典2010、GB14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法以及GB15810一次性无菌注射器来学习具体试验方法。第29页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三实验步骤浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：V－－浸提介质体积，单位为（ml）；L－－产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的细菌内毒素的量），单位为EU/件；λ－－鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。第30页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三实验步骤样品处理方法：a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验；b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验。制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求供试液的PH值在6.0~8.0之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家提供的PH缓冲液调节浸提液的PH值。第31页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三关于内毒素实验凝胶法第1页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三内容基本概念实验方法操作注意事项第2页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三细菌内毒素细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物,它主要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。第3页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三一、概念及相关知识热原反应：病人在静脉给药15分钟后发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、昏迷、休克等症状。热原：任何可以导致肌体发热的物质。机理：外源性热原质通过内源性热原质起作用。外源性热原质吞噬性白细胞内源性热原质体温调节中心发热新蛋白合成新mRNA翻译第4页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三1942年，美国药典首次收载热原检查法，中国药典自第一版（1953年版）起收载。所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检查。热原检查法的局限性：1、重现性差。2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。4、非定量反应。虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内毒素是最主要的热原物质。第5页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三细胞壁结构：肽聚糖脂蛋白革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌外膜磷壁酸脂多糖细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。脂多糖结构：多糖O抗原＋核心多糖＋类脂A致热活性部分第6页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三细菌内毒素的生物活性1、致热性。2、致死性毒性。3、白细胞减少。4、激活凝血系统。5、降低血压，休克。6、Shwartzman反应。7、刺激淋巴细胞有丝分裂，等等。第7页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三细菌内毒素的耐热性细菌内毒素具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能去除细菌内毒素，需250℃至少30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活。第8页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三实验用器具的处理内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可能存在的外源性内毒素。耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内180℃干烤至少2h或者250℃干烤至少30分钟；塑料器皿置于30％双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗，60℃烘干备用。第9页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三细菌内毒素的单位内毒素的量值：1、内毒素单位（EU）1982年FDA将当时美国代号为EC－2的内毒素标准品规定为5EU/ng。1983年内毒素单位（EU）被USP正式引用。2、国际单位（IU）WHO先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法，且明确1IU＝1EU。第10页，讲稿共43页，2023年5月2日，星期三细