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基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

生物技术通报

技术与方法

ＢＩｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ

ＢＵＬＬＥＴｌＮ

２０１１年第５期

基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌

基因功能组学讨论中的应用

冀颖

李梅蒋细良

（中国农业科学院植物爱护讨论所农业部生物防治重点开放试验室，北京ｌＯ００８１）

２０１１年第５期

冀颖等：基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌基因功能组学讨论中的应用

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化提醒目标基因的功能。１．２基因打靶技术的技术路线

１９８５年，首次证明在哺乳动物细胞中存在基因同源重组，为基因敲除技术的创立奠定了理论根底。１９８７年，Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ等…胜利地构建了动物一小鼠敲除模型，为基因敲除技术的应用奠定了实践根底。近２０年来，此项技术已经由在酵母和哺乳动物中的应用，拓展到了植物、真菌基因功能的讨论中。其大致要包括构建载体、真菌转化、筛选突变体和分析表型等步骤。

１．２．１

构建打靶载体打靶载体由３局部组成，包

括两端与靶基因两侧同源的同源臂序列以及中间的选择性标记序列。

真菌中打靶载体的选择标记，通常采纳养分选择性标记基因如ｐｙｒ４、ａｒｇＢ、ｔｒｐｃ和ａｍｄｓ等，以形成互补受体菌的养分缺陷型。由于工业丝状真菌中相应养分缺陷型作宿主很难获得，因此后来又开发出显性选择标记，主要是抗生素标记基因，典型的如潮霉素、新霉素或腐草霉素和氨基糖苷类抗生素Ｇ４１８等旧。，携带此类抗性基因的质粒均可转化到真菌中，并表现出选择性抗性。此外，对化合物苯菌灵显示抗性的一些Ｂ．微管蛋白突变基因，绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）近年来也被作为报告基因在丝状真菌基因工程中得以应用旧－。

通过基因重组进展基因敲除要求已知靶基因两侧的侧翼序列，但不同生物中所要求的侧翼序列长度不同。在酵母菌中，仅需要５０ｂｐ的同源臂序列，就可以完成与目标基因的融合；但对丝状真菌而言，则通常需要至少５００一１

０００

ｂｐＨｌ。这就要求将同

源臂序列与抗性基因序列融合的过程中，依据所需要的靶序列的长度，采纳相宜的方法，以提高融合的效率。

早期，人们通常采纳屡次克隆，纯化等步骤构建基因替换盒。对于背景简洁的靶基因而言，这种方法比拟有用。但对于丝状真菌而言，要求扩增较长的同源序列，就需要屡次克隆步骤，增加了序列扩增中碱基突变的可能性，导致克隆效率降低，因此需要

建立一种简洁快速的构建打靶载体的技术——融合

ＰＣＲ技术应运而生。

融合ＰｃＲ又称为双接头ＰｃＲ”’，是一种基于

万方数据

ＰｃＲ技术的高效地构建打靶载体的方法。其原理是采纳末端具有反向互补序列的引物进展ＰｃＲ，形

成具有互补链——“尾巴”的序列，从而依靠这段互

补序列，将同源臂序列和抗性基因序列连接起来。这样将省去屡次克隆、酶切和连接等简单的步骤，提高效率。

融合ＰｃＲ技术构建打靶载体通常需要３个连续的ＰＣＲ反响，第一轮ＰＣＲ反响：通常以基因组为模板，分另Ⅱ以５’．Ｆｏｒ。５’．Ｒｅｖ＋ｍａｒｋ．ｔａｉｌ；３’．Ｆｏｒ＋

ｍａｒｋ－ｔａｉｌ，３’－Ｒｅｖ；５

７．ｍａｋｅｒ，３’．ｍａｋｅｒ（图１）为引物进

行扩增得到的ＰＣＲ产物分别为５７．侧翼序列（带有与选择性标记基因序列互补的“尾巴”），３’．侧翼序列（带有与选择性标记基因序列互补的“尾巴”），以及选择性标记基因（图２）。经电泳检测后，直接进展其次轮ＰｃＲ：不加任何引物，将５’．侧翼序列，３’．侧翼序列和选择性标记基因以等摩尔数依次参加反响体系中（要求３个片段的ＤＮＡ含量在１００一

１

０００

ｎｇ），进展ＰｃＲ获得３个片段融合的片段（图

２）；第三轮ＰｃＲ：以３’一ｎｅｓｔ；５’－ｎｅｓｔ为引物（图１）进展ＰＣＲ富集３段基因融合的终产物（图２）。终产物可以直接用于连接等后续操作，无需进展纯化。

＋５ＬＦ∞…６二Ｒｅｖ＋ｍａｒｋ一诅ｉｌ…．ｍａｒｋ—ｔａｉｌ＋３：Ｆｏｒ…．３ＬＲｅｖ＋

一一一一一～ｆ．《ｒＧ——Ｔ姆ａＧ朋ｅｏＲＦ卜一一一一一一

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图１特异性引物的设计

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