凝胶色谱柱操作1 - 化学工业.docxVIP

床与洗脱液贮瓶及收集器相连，设置好一个适宜的流速，就可以定量地分布收集洗脱液。然后根据溶质分子的性质保存为主。凝胶色谱柱的使用方法看到很多虫友问葡聚糖凝胶的使用方法，所以将自己的一点经验写下来，以作参眼观察柱内是否有路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如和回收凝胶柱多次使用后,

床与洗脱液贮瓶及收集器相连，设置好一个适宜的流速，就可以定量地分布收集洗脱液。然后根据溶质分子的性质

保存为主。凝胶色谱柱的使用方法看到很多虫友问葡聚糖凝胶的使用方法，所以将自己的一点经验写下来，以作参

眼观察柱内是否有路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如

和回收凝胶柱多次使用后,若污染严重，则考虑用5

1、溶胀

商品凝胶是干燥的颗粒,通常以40～63um的使用最多.凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天,如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1～2小时。凝胶的溶涨一定要完全,否则会导致色谱柱的不均匀.热溶涨

法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡.

2、装柱

由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填.凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡.最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板.将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗,颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升,在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面,再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一

段时间。

3、柱均匀性检查

凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀,在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的,检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整,即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不

规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱.

4、上样

凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心.样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时,必须将样品

的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔脱脂棉以保护柱表面（我一般不加）,然后即可进行洗脱。(4)洗脱与收集洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连果观察到柱内谱带窄、均匀、平整,即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口.用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。

的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样

渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔

脱脂棉以保护柱表面（我一般不加）,然后即可进行洗脱。(4)洗脱与收集洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连

果观察到柱内谱带窄、均匀、平整,即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝

坏凝胶柱的床层。

5、冲洗

凝胶色谱的流动相一半多采用水或缓冲溶液,少数采用水与一些极性有机溶剂的混合溶液，除此之外，还有个别比较特殊的流动相系统，这要根据溶液分子的性质来决定。加完样品后,可将色谱床与洗脱液贮瓶及收集器相连，设置好一个适宜的流速，就可以定量地分布收集洗脱液。然后根据溶质分子的性质选择光学、

化学或生物学的方法进行定性和定量测定。

6、再生

因为在凝胶色谱中凝