实验 一二三四---- DNA重组技术.pptxVIP

实验一二三四----DNA重组技术;碱裂解法小量制备质粒DNA;一．实验目的及背景;质粒的应用;本实验目的;分离质粒DNA方法;溶菌酶

碱裂解：SDS,NaOH

pH12.0-12.5

中和：pH4.8醋酸钠;碱变性法基本原理;实验方法;Ⅱ型酶;酶切反应注意事项：;２．ＤＮＡ：;３．反应缓冲液：;４．酶解温度与时间：;;２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。

３．Eppendorf管于３７℃水管中反应２小时。

４．反应结束后加入Loading buffer终止反应。

５．取１5μl于１％琼脂糖凝胶上电泳。

６．紫外透射仪上检查实验结果。;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳; 琼脂糖凝胶电泳 ;注意事项

合适的凝胶浓度正确的电泳方向;胶回收;核酸的体外连接;注意事项

1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。

2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。

3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃

冰冻保存将会降低转化效率。

4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。

5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5‘磷酸基处理，使用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。;大肠杆菌感受态细胞的制备和转化;一．实验目的及背景;学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法，并通过转化的方法导入DNA。;实验原理;通过CaCl2处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。在0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。;带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的表型，

使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。;材料、试剂及器具

1、 材料

E.coliDH5α

转化产物

2、 试剂

（1）0.1mol/LCaCl2（灭菌）。

LB液体培养基、固体培养???。

氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成

100mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。;3、器具

超净工作台。

恒温水浴锅。

恒温摇床、培养箱。;操作步骤;4000rpm，离心10min回收细胞

↓

用冰冷的0.1mol/LCaCl21mL，悬浮沉淀

↓

立即放在冰上保温30min

↓4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞

↓

用冰冷的0.1mol/LCaCl20.1mL悬浮细胞（务必

放冰上）

↓

分装细胞，每100μl一份。此细胞为感受态细胞;质粒/连接产物的转化;↓3000rpm，离心5min回收细胞

↓

吸弃450μl上清后，轻轻重悬细胞，全部铺平板，待菌液干燥后倒置培养皿，于37℃培养过夜

↓

次日观察，并记录转化情况，计算转化率（转化子数/μgDNA）。;细胞生长状态和密度

质粒的质量和浓度:

1ng的DNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。;感谢您的关注