细胞凋亡与免疫.pptVIP

*1.形态学方法2）荧光显微镜观察：荧光染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、溴化乙锭(EB)等染色,在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成。这种方法适用于对体外培养细胞悬液的检测,组织脱蜡切片经RNA酶作用后也可用此法染色观察。荧光显微镜检查法方便易行,现已成为细胞凋亡检查的常用手段。第63页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*Onthisslidetheeasiestandhistoricallyfirstwayofidentifyingapoptoticcellsisshown.InthisassaythebluefluorescentdyeDAPI(4,6-Diamidine-2-phenylindoledihydrochloride)hasbeenused,whichspecificallystainsDNA.第64页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*?1.形态学方法3）透射电子显微镜观察：凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小,细胞质浓缩,内质网、线粒体增多,细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小体。超微结构观察是诊断细胞凋亡最可靠的方法。但该法只能定性,不能定量,而且观察到凋亡小体的几率也不高,在体内试验时,凋亡小体可能很快被巨噬细胞吞噬清除,而不易观察到;此外,用电子显微镜检测细胞凋亡,样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵。第65页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*第66页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*1.形态学方法4）共聚焦激光扫描显微镜检测：共聚焦激光扫描显微镜是20世纪80年代发展起来的一种新型仪器,是在荧光显微镜的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使紫外光和可见光激发荧光探针,从而得到清晰的细胞内部结构。该方法能用于细胞的形态学分析,而且还能对凋亡细胞内的大分子进行定位。第67页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*2.生物化学方法：（1）典型的细胞凋亡显示出DNA梯形电泳图谱：细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180～200bp长的DNA片段或整数倍的寡核苷酸片段。凋亡细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱,而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状第68页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker（自赵允、翟中和）第69页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*第70页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*2.生物化学方法：（2）原位末端转移酶标记技术：凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口)，暴露出大量3’末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。第71页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*?2.生物化学方法：由DNA片段末端标记技术发展而成的TUNEL法[terminadeoxynucleotibyltransferase(TdT)-mediateddUTP-biotinnickendlabelling,TUNEL]及试剂盒化,使细胞凋亡的原位检测在诸多领域的研究中得到广泛应用。第72页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*第31页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*凋亡细胞的特征性表现：包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。破坏细胞抗凋亡因素破坏细胞结构影响核酸的结构与功能Caspase的效应机制第32页，讲稿共102页，2023年5月2日，星期三*破坏细胞抗凋亡因素正常活细胞内核酸酶处于无活性状态。这是由于核酸酶和抑制物结合在一起（如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化）。现知caspase可以剪切裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspas