免疫共沉淀详细步骤.docxVIP

免疫共沉淀详细步骤

实验原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合； 也可用

于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：

（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用；

（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

实验试剂

1.RIPABuffer配制：基础成分:

Tris-HCI（缓冲液成分，防止蛋白变性）

NaCI（盐份，防止非特异蛋白聚集）

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用 H2O配制成10%储存液；

避光保存）

注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）

EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用出0配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用出0配制成1mg/ml的储存液，分装，-

20C保存）

胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20C保存）

RIPA磷酸（酯）酶抑制剂

激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium

OrthovanadateActivationProtoco）

NaF（200mM的储存液，室温保存）

注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制:

配制100ml的modifiedRIPAbuffer:

1） 称取790mg的Tris-Base,加到75ml去离子水中，加入900mg

的NaCI，搅拌，直到全部溶解，用HCI调节PH值到7.4

2） 加10ml10%的NP-40

3） 加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清

4） 力口1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml,2-8C保存

5） 理论

上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入 （抑

蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100门PMSF,NaVO4,s

NaF各5000,但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一

半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳

定5天。

各种成分在工作液中的终浓度：

ATris-HCI:50mM,pH7.4

NP-40:1%

去氧胆酸钠：0.25%

NaCl:150mM

EDTA：1mM

PMSF:1mM

抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各 10g/ml

Na3VO4：1mM

NaF:1mM

实验步骤

准备工作：

预冷PBS,RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机

用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；

加入预冷的RIPABuffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或勺150cm2

培养瓶，0.5ml/5X106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）；

用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到

1.5EP管中，4C,缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；

4C,14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；

准备ProteinAagarose,用PBS洗两遍珠子，然后用PBS配制成

50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；

每1ml总蛋白中加入100PlProteinA琼脂糖珠（50%）,4C摇

晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景；

4C,14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去

除Prot