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免疫组化操作步骤

第一节免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考）

第二节免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）

（一） 、仪器设备

18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.

水浴锅

（二） 、试剂

PBS缓冲液（pH

7：2-

7.“4）

2.

0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH

“0,1000ml）

3%甲醇一H

2O

2溶液：

用30%H

2O

2和80%甲醇溶液配制

风裱剂：

a.甘油和

0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH

9.0-

9.5)等量混合b油和TBS(PBS)配制

TBS/PBSpH

9.0-

9.5,适用于荧光纤维镜标本；pH

0-

7.4适合光学纤维标本

、操作流程

1、 脱蜡和水化：

脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60C恒温箱中烘烤20分钟。

a组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后在浸泡10分钟

b无水乙醇中浸泡五分钟

c95%乙醇中浸泡五分钟

d75%乙醇中浸泡五分钟

2、 抗原修复：

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

抗原修复(免疫组化石蜡切片)

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复

福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。

抗原修复的几种常用方法（供参考）

微波炉加热：

在微波炉里加热

0.01枸橼酸钠缓冲液（pH

0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法〃3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。

适用的抗原：

来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本：

沸热修复：

电炉或水浴锅加热

0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH

6.0）至95C左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

高压热修复：

在沸水中加入EDTA（pH

0）或

0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH

6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复）

酶消化方法：

常用

0.1%胰蛋白酶和

0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37°C，消化时间约为5-30分钟。

适用于被固定遮蔽的抗原：

包括Collagen.GFAP.Complement.Cytokeratin,c-erB-

L

C

A.LN.等

石蜡切片免疫组化染色步骤

1.三步法（以SP试剂盒为例）

?石蜡切片脱蜡至水。

?蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。

?3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟x3次。

?5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37C孵育1~2小时或4C过夜。

?PBS冲洗，2分钟x3次。

?滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37°C孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37C或室温孵育10~20分钟。

PBS冲洗，2分钟x3次。

?滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37C孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37C或室温孵育10~20分钟。

PBS冲洗，2分钟x3次。

?显色剂显色（DAB或AEC）。

?自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片。

?如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素。

2.SABC法

（1） 脱蜡、水化

（2） PBS洗2次各5分钟

（3） 用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次

（4） 抗原修复

（5） PBS洗5分钟

（6） 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体

（7） 滴加I抗50ul,室温静置1小时或4C过夜或37C1小时

（8） PBS洗3次各2分钟

（9） 滴加生物素化□抗，20C-37C20分钟

(10)PBS洗3次各2分钟

滴加试剂SABC20°C-30°C20分钟

PBS洗4次各5分钟

DAB显色：

试剂盒或自配显色剂显色

(14)脱水、透明、封片、镜检。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

?速冻组织

?冰冻切片4~8pm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20C冰箱。

?室温放置30分钟后，入4^丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其他的固定方式。

PBS冲洗