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免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明

一、试剂和溶液

乙醇：无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液：0.01M的柠檬酸钠缓冲液：58.82g柠檬酸三钠及7.56g柠檬酸溶于200ml纯水，调pH至6.0，纯水1:100稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇：30%的过氧化氢与无水甲醇1:9稀释10XPBS:80gNaCl，2gKCl,14.4gNa2HPO4和2.4gKH2PO4加1L纯水，调pH至7.4洗涤液:bPBS:纯水稀释10xPBS；1xPBST:含0.05%Tween-20的bPBS（bPBST）superblock，生物素标记的UltraTekAnti-Polyvalent二抗，酶标亲和素UltraTekHRP，DAB显色试剂盒：Cat.KT1002a抗体稀释液：3%BSA-PBS0.5%盐酸-乙醇：0.5~1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g溶于250ml无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g溶与750ml纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g和冰醋酸20ml

二实验步骤

组织固定：烘箱温度65-75口30min或者65口过夜；

脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10分钟；

水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；

洗涤：自来水冲洗1次，PBS浸泡3min；

抗原修复：放入稀释100倍的柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，高压锅煮沸

10min，常温冷却30min；

洗涤：纯水浸泡2次，PBS浸泡1次，每次3min；

灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；

洗涤：纯水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；

封闭:加入适当体积的superbloc(KT1002aReagentA),37口温箱孵育5min；

洗涤：纯水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；

一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗,37口湿盒孵育60min。

洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

加入适当体积生物素标记的 UltraTekAnti-Polyvalent的二抗(KT1002a

ReagentB),37口湿盒孵育10min；

洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

加入适当体积酶标亲和素UltraTekHRP(KT1002aReagentC),37口湿盒孵育10min；

洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

显色：滴加适量DAB显色液(KT1003a)至切片上，室温显色1?5min，自来水冲洗；

复染：苏木素染色5min，蒸馏水冲洗5min；

分化：0.5%盐酸乙醇混合液中分化，自来水冲洗3-4次，PBS中浸泡10-

20秒返蓝，自来水冲洗2次。

脱水：经过70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，无水乙醇浸泡，每次5min；

透明：二甲苯浸泡2次，每次10-15min；

封片：晾干后加中性树胶，盖玻片封片；

结果：显微镜观察，记录结果