DB63T 1908-2021青稞种子纯度SNP分子标记鉴定技术规程.docxVIP

ICS65.020.20

CCSB21

备案号：

青海省

DB63

地方标准

DB63/TXXXX—2021

青稞种子纯度SNP分子标记鉴定技术规程

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(报批稿)

2021-XX-XX发布

2021-XX-XX实施

青海省市场监督管理局发布

I

DB63/TXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1─2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由中国科学院西北高原生物研究所提出。

本文件由青海省农业农村厅归口。

本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站。

本文件主要起草人：沈裕虎、王寒冬、徐金青、王蕾、王焕强、包天忠、陈文杰、孔豆豆。本文件由青海省农业农村厅监督实施。

1

DB63/TXXXX—XXXX

青稞种子纯度SNP分子标记鉴定技术规程

1范围

本文件规定了青稞种子纯度SNP分子标记鉴定相关术语和定义、仪器设备及试剂、溶液配制、KASP引物信息、引物选择、操作程序、数据记录与统计、种子纯度计算等技术要求。

本文件适用于青稞品种(系)和种质资源种子纯度检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样

GB/T3543.4农作物种子检验规程发芽试验

GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法

GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

推荐引物

种子纯度鉴定时优先选用的一套SNP引物。

4仪器设备及试剂

本文件所使用的水均为一级水，符合GB/T6682的要求。除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂。见附录A。

5溶液配制

见附录B。

6KASP引物信息

2

DB63/TXXXX—XXXX分为Ⅰ、Ⅱ两组。其他在本文件中未推荐的非连锁引物也可使用。见附录C。

7KASP引物选择

首先选择附录C中Ⅰ组引物进行扩增，当样品间检测出的差异位点数＜2时，直接选用附录C中Ⅰ、Ⅱ组所有引物进行扩增。

8操作程序

8.1样品准备

8.1.1扦样

按照GB/T3543.2的规定，各待检品种分别进行扦样、分样；每品种籽粒(种子)分为3份，一份用于检测，一份留作复检，另一份用于备份。

8.1.2发芽

按照GB/T3543.4的规定进行发芽，发芽籽粒(种子)数需≥50个。

8.1.3叶片采取

待植株长至三叶一心时，按单株采取真叶进行样品制备。

8.2样品制备

8.2.1DNA提取

按照GB/T19495.3的规定进行DNA的提取。按照GB/T3543.5的规定，每各待检品种制备的DNA样品数量需≥50个单株；单提、单检。

8.2.2DNA质量检测

按照GB/T30988中的DNA纯度、浓度测试进行DNA质量检测。

8.3实时荧光定量PCR仪SNP分型

SNP分型操作流程如下：

1)将DNA样品编号后分别加到96孔PCR板上对应编号的反应孔中，每块PCR板均需加2个及以上的阴性对照(NTC，即除由等量的超纯水替代DNA样品外，余所加试剂完全一致)。DNA样品尽量往PCR板中部摆放，避免放在PCR板的四个角上，每块PCR板尽量只检测一个待检品种。

2)依待检样品量按照表1，配制一定体积的KASP基因分型混合液。配制前所有试剂均应短暂地涡旋振荡，补足损失的体积；引物原液稀释至10μmol/L。

表1KASP基因分型混合液

试剂

体积(μL)

2×KASPMastermix

5

Primer_Allele[FAM]

0.5

Primer_Allele[HEX]

0.5

3

DB63/TXXXX—XXXX

表1KASP基因分型混合液(续)

试剂

体积(μL)

Primer_Common

1

超纯水

1

总体积

8

3)使用微量移液器将步骤2)中的KASP基因分型混合液分别加入到步骤1)已加入DNA样品的PCR板上的反应孔中，每孔加8μL。

4)用荧光透视的膜将P