农杆菌感受态制备.docxVIP

版本一?

1.1农杆菌感受态细胞的制备？

°C保存的EHA105于含50pg/ml链霉素平板划线，28°C培养。？

^振荡培养12-16hr。?

C220rpm振荡培养至OD600=0.5。?

?

C5000rpm离心5min,去上清。?

?

C。?

1.2.双元载体转化农杆菌EHA105?

取1pg左右的质粒DNA加入到200mlEHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴

30min,-70C放置10min。再在37C水浴5min或42C水浴1min,接着冰浴2min,加入800mlYM液体培养基28C,175rpm摇培3hr后涂在含50pg/mlKanamycin的YM平板上。28C培养到形成单菌落。

其中YM可以用LB代替，第一次的CaCl2溶液可用溶液（0.1MCaCl2

0.01Tris-HCl（7.0）0.01DTT）替代。

版本二？

普通农杆菌感受态制备与转化：？

挑单菌落于2mlYEP培养基（含Rif20mg/ml）中28C过夜活化。？

取2ml过夜菌液接种于50mlYEP培养基中28C生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。?

5krpm离心5分钟。?

在10ml0.15MNaCl中悬浮细胞。？

5krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。?

如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80°C待用。？

加1ugDNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。？

液氮中冷冻1分钟。？

37C水浴溶化细胞。？

加1mlYEP培养基，28C摇床培养2-4hr（低速）。？

离心1分钟，悬浮细胞在100ulYEP培养基中。？

涂板，28C培养2-3天。？

版本三

农杆菌感受态细胞的制备

挑取少许农杆菌LBA4404,接种于5mlLB液体培养基（含50mg/LSTR）中，28C、200r/mim培养过夜。

取2ml培养物于LB液体培养基（含50mg/LSTR）中继续培养，直至OD800为0.5左右。

将培养物置冰浴中30min，4C、5000r/min、离心5min，弃去上清液。

用10ml冷的0.1mol/LNaCl悬浮菌液。

5.4C、5000r/min，离心5min，弃去上清液。

6.用1ml冷的CaCl2（20mmol/L）悬浮，分装成50心管，液氮中冷冻后至-80C保存。

农杆菌感受态细胞的制备：

试剂配制:solution1:Rbcl1.21g100mM

MgCl2.4H2O1.02g50mM

K-Acetate0.29g30mM

CaCl2.2H2O0.15g10mM

Glycerol15%15ml，定容至100ml。

pH=5.8,121度，高压灭菌30min。

solution2：Rbcl0.12g10mM

K-Acetate0.1g10mM

CaCl2.2H2O1.1g75mM

Glycerol15%15ml，定容至100ml。

pH=5.8,121度，高压灭菌30min。

农杆菌感受态细胞的培养：

15-20ml无抗生素的LB培养基，用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中，28度120转震荡培养过夜。（注意牙签和小三角瓶均需灭菌）

制备感受态农杆菌把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到1.5ml小离心管中，室温下，4，000g，离心10min。弃去上清，每管加0.5mlsolutionl，用手指弹管底部，以使菌体悬浮。冰上放置15mim-2h。4度，4,000g，

离心10min。取出后放在冰上，弃去上清，每管加0.5mlsolution2，用手指弹管底部，以使菌体悬浮，冰上放置15mim。分装感受态农杆菌，每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-80°C冰箱中保存。

版本四

1） 从新鲜YEP（5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母浸出物，10g/L琼脂，

50mg/L利福平，pH7.0）平板上挑取农杆菌LBA4404的单菌落，接种于5ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中，28C200r/min振摇培养过夜。

2） 取1ml菌液接种于50ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中扩大培养，

28C200r/min振摇培养至OD600为0.5。

3） 冰浴30min，4C5000r/min离心收集菌体，重悬浮于10ml0.15mol/LNaCl溶液中。

4） 再次4C5000r/min离心收集菌体，重悬浮于1ml20mmol/LCaCl2溶液中，

按200micro;l/管分装。制备好的感受态细胞若不立即使用，液氮速冻1min后，放于-70C冰箱保存，半年内使用。

版本五

YEB培养基（用于