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非特异性的嵌入荧光染料

（Non-specificDNAbindingdyes）SYBR?GreenISYBR?GoldEthidiumBromide第31页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三Extension5’3’5’3’5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’RepeatDNAbindingdyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll第32页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三实时PCR技术原理目录第33页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三非特异性的嵌入荧光染料评价优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜只需要设计PCR引物缺点：由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目的基因的扩增情况。第34页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三TaqMan探针评价优点：荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测可用于SNP的检测缺点：比DNA结合染料价格高第35页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheoryCt值（ThresholdCycle）PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。第36页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三模板起始浓度越高，Ct值越小Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达第37页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。第38页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三第39页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三3、原位PCR技术第40页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列第41页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三16块载玻片及24个0.2ml管的样品block第42页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三第43页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达第44页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三DNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。4、基因芯片分析基因表达谱（高通量地分析基因表达）基因芯片(genechip)第45页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三目录第46页，讲稿共81页，2023年5月2日，星期三二、通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征Western印迹（Westernblot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经Western印迹可直接测定基因编码多肽