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不同方法提取卵黄抗体的对比

随着禽畜业的迅速发展，其规模化程度越来越高，抗生素滥用导致的细菌耐药性及抗生素残留问题也越来越突出。加快寻找和使用其他安全可靠的产品来取代抗生素成为行业亟待解决的问题。鸡源性的卵黄免疫球蛋白被认为是一类非常重要的免疫物质，其作用机制在于，可以抵御外界的病毒，并且可以促进免疫系统的正常运作[1]，其作用机制主要表现在促进免疫反应，如促进免疫系统的活性和免疫耐受性，减少病毒的传播，防止病毒的蔓延。除了具备抵御病毒感染的能力，卵黄抗体也被证实是一种非常有效的毒素抑制剂，它的稳定性极佳，特异性极强[2]，完全没毒，没有任何残余，也没有出现任何耐药现象，而且它还能够提升机体的免疫力，因而，它已经成为动物的健康监测、预防与治疗的首选手段[3]。随着卵黄抗体的持续发展，它的独特性、疗效显著超越了传统的抗生素，成为一种可以快速获得、精确分析、低毒副反应、安全可靠的新一代“抗生素”。它的出现，使得抗生素的使用更加安全、环保，在畜牧业中发挥着越来越重要的作用[4]。

在鸡蛋黄中，蛋白质和脂肪的比例通常在1∶2之间，而这些物质的组成主要由蛋白质和脂肪组成的脂蛋白。然而，这些脂蛋白很难被水解，而磷脂和不饱和脂肪酸也容易发生化学反应，从而使得抗体的有效性受到影响，因此，给动物注入发生化学反应的抗体可能会导致动物的死亡。由此去除卵黄抗体的脂蛋白和脂质是至关重要的，若无法有效地去除这些成分，将可能导致其应用于动物的免疫系统中，从而造成极其危险的后果[5]。因此，有效地去除这些成分变得至关紧迫。在这项研究中，我们使用了多种技术来提纯卵黄抗体，并对它们的优势和劣势进行了全面的评估，旨在寻求最佳的技术，并将这些结果应用于未来的生产实际[6]。

1材料与方法

1.1试验材料及仪器

tg16g台式高速离心机、10~100μl8道移液器、96孔V型微量板、XK96-3型微量振荡器以及北京勃林格殷格翰的高免蛋鸡，均按照常规的鸡类免疫程序进行了处理，以满足实验需求。

1.2主要试剂

新城疫标准抗原（批号：202111、中国兽医药品监察所）、禽流感H9亚型标准抗原（批号：2021001、哈尔滨维科生物技术有限公司）、辛酸（批号国药集团）、无水乙酸钠（批号国药集团）、三氯甲烷（批号天津市科密欧化学试剂有限公司）、PBS缓冲液（干粉）（批号：Pcoolaber）、盐酸分析纯（批号天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙酸分析纯（批号天津市福晨化学试剂）、75%乙醇（批号山东福尔特消毒制品有限公司）。

1.3试验方法

为了确保产品的安全，我们需要对所有的鸡蛋进行处理。我们需要把它们放在42℃的0.1%新洁尔灭溶液中浸泡15min，接着，我们需要使用75%的乙醇来彻底洗涤，以消灭它们的细菌。最终，我们需要把它们分开，分离出蛋清和蛋黄，丢弃蛋清，只保留蛋黄。接下来，我们就要按照如下步骤来提取卵黄抗体[7]。

（1）酸化水提取法：将卵黄和纯化水按照1∶8的体积混合，即1mL卵黄+8mL纯化水，震荡均匀，用20%的稀盐酸调节pH值为5.2，4℃静置6h，然后4℃、10000r/min离心25min，弃掉沉淀，收集上清液即可[8]。

（2）氯仿萃取法：将卵黄和PBS缓冲液（pH7.5）按照1：8的体积混合，再加入同体积的三氯甲烷。即1mL卵黄+8mLPBS缓冲液，混合均匀，加入9mL三氯甲烷，振荡均匀，4℃、10000r/min离心30min，取上层清液即可[9]。

（3）将卵黄液和乙酸钠缓冲液按1∶8的比例混合，1mL卵黄液和8mL乙酸钠缓冲液混匀，再加入25%的辛酸，搅拌30min，最后以6000r/min的速度离心20min。将沉淀物抛弃，取出上层清澈的液体[10]。

（4）安检试验：我们从10日龄的SPF鸡中挑选出40只，将它们随机地划分到4组，其中第3组接受免疫，第4组作为对照。我们将SPF鸡按顺序接种卵黄抗体，而另一组接种了与之相当的生理盐水，最终将它们置于相同的环境中，通过14d的持续监测，以确保实验结果的准确性。

（5）抗体效价检测

①血凝试验：将96孔的微量板放置，从第1孔到第12孔中添加0.1MPBS0.025mL，在第1孔中添加0.025mL的血凝素标准抗原，接着按顺序进行2倍的稀释，一直到第12孔。弃去第12孔的稀释液，并设置红细胞对照孔，然后从第1孔到第12孔加入1%鸡红细胞悬液0.025mL，在振荡器上混合均匀后，在10~30℃的环境下，静置20~40min，到对照孔中的红细胞呈显著纽扣形态，即可确认结果，使其100%的凝集的稀释度，确认为其凝集价。