富源某猪场高致病性蓝耳病及猪圆环病毒病的实验室检测.docxVIP

富源某猪场高致病性蓝耳病及猪圆环病毒病的实验室检测

1前言

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染所致的一种急性传染病，以繁殖障碍、呼吸系统疾病等为主要特征，主要引起母猪流产，产死胎、弱仔等临床症状，简称猪蓝耳病。蓝耳病是一种接触性的传染病，呈地方性流行，一年四季都可发病，以夏秋两季最为严重。持续性感染是蓝耳病的重要特征，PRRSV在感染猪体内存在时间长，通过血液循环引起胎猪受到感染。2022年9月份，富源某猪场部分猪只陆续出现不明高热，发病猪主要是保育猪，死亡淘汰率在20%~30%。根据临床及剖检特点，怀疑有蓝耳病或圆环病毒病的存在，而且这2种疾病会引起动物机体严重的免疫抑制，因此，检测了PRRSV和PCV2，为猪场进一步采取全面、有效的措施打下了基础，提供了方向。

2材料与方法

2.1实验地点和时间

本试验于2017年2—5月在云南农业大学牧医楼404实验室进行。

2.2病料来源

2017年2月份富源大河某猪场不同时间、不同周龄发病猪的脾脏、肺脏、淋巴结等病变器官，共15份。

2.3实验材料

2.3.1仪器

手术剪刀、眼科剪刀、酒精灯、台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统、恒温培养箱、恒温水浴锅、电子秤量器、摇床、离心管、枪头、乳胶手套等。

2.3.2溶液及试剂

化学试剂：TE缓冲液（含RNA酶）、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、70%乙醇。酶类：蛋白酶K、RNA酶等。电泳类试剂：1×TBE电泳缓冲液、6×蔗糖上样缓冲液、溴化乙啶溶液（EB）、琼脂糖凝胶。

2.4实验方法

2.4.1PRRSV的检测

（1）病毒RNA的提取

取病料脾脏、肺脏和淋巴结病变组织，液氮研磨。应用TRIZOLReagent细胞裂解液按常规方法提取组织总RNA，用于病毒基因组反转录和PCR扩增。提取过程中所有的器皿及消耗品均用DEPC处理，避免RNA酶的污染，给获得组织RNA带来困难。

（2）RT-PCR扩增

①在微量离心管中配制如下表1溶液，置于冰盒上混匀，37℃下静置10min后移入42℃水浴锅中保温1h。

表1微量离心管中配制溶液

②PCR反应体系：在微量离心管中配制如下表2DNA溶液（置于冰盒上）。

表2微量离心管中配制DNA溶液

③扩增DNA片段的PCR反应条件如下：

（3）电泳检测

①1%琼脂糖凝胶的配制称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mLTBE工作液，混匀后将该三角瓶置于微波炉加热煮沸10sec，加入20μL（约1滴）溴化乙啶（1mg/mL），混匀后室温降温至50℃左右。用挡板封住胶板，在固定位置放上梳子，将凝胶缓慢倒入胶板，室温下静止30min左右，待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子。拔掉挡板，将凝胶板放入含有TBE缓冲液的电泳槽中。

②点样取5μL提取的动物基因组DNA，分别与适量的溴酚蓝（样品的1/5）混匀后，点入凝胶孔内。同时将分子量标记5μL（GL2000）也点入凝胶第一孔位置内。注：GL2000分子量标记分别是：2000、1600、1000、750、500、250和100bp。

③电泳接通电源后，将电泳仪的电压调至100V，电泳1h左右，溴酚篮移动距点样孔2cm左右，停止电泳。

④观察和拍照将凝胶从凝胶板上取下，放到紫外观察箱中，打开紫外观察灯254nm，可见到大分子量的动物基因组DNA。凝胶DNA的拍照采用凝胶成像仪。

（4）目的基因的纯化

将RT-PCR扩增出的目的片段胶回收，使用大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKitVer.2.0试剂盒进行回收，将胶回收的产物送至大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）进行测序。

2.4.2PCV2的检测

（1）病毒DNA的提取

用剪刀剪取病猪脾脏、肺脏和淋巴结组织约0.2~0.5g于1.5mL离心管内。加入700mLSTE液（含RNA酶），同时加入77mL10%SDS液（总体积1/10），用眼科剪刀剪碎组织样品。加入20mL蛋白酶K（20mg/mL），指弹混匀。70℃消化20min后加700mLTri饱和酚，置脱色摇床抽提10min。12000r/min离心1min，取上清液于另一1.5mL离心管中。加700μL酚氯仿（1：1）于离心管中，置于脱色摇床抽提10min。12000r/min离心1min，取上清液于另一1.5mL离心管中。加700μL氯仿－异戊醇（24∶1），置于脱色摇床抽提10min。

（2）PCR扩增

①在微量离心管中配制如下表3DNA溶液（置于冰盒上）。

表3微量离心管中配制DNA溶液

②扩增DNA片段的PCR反应