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融合HisTag重组蛋白的基因克隆、表达及亲和纯化的综述报告

重组蛋白已成为生命科学研究、药物开发和工业应用的重要工具。融合HisTag的重组蛋白广泛应用于免疫组化、酶标测定、晶体学研究、药物筛选等方面。本篇综述将介绍HisTag重组蛋白的基因克隆、表达及亲和纯化的技术原理和方法。

一、基因克隆

基因克隆是制备HisTag重组蛋白不可或缺的步骤。常用的基因克隆方法有PCR扩增、限制酶切和基因合成等。

PCR扩增是在模板DNA的基础上，通过引物特异性结合目的基因序列进行PCR扩增，得到所需的基因片段。这种方法简单易行，扩增效率高，适用于小片段基因的克隆。

限制酶切则是在目的基因序列两端引入合适的限制酶切位点，在反转录模板的基础上采用限制酶消化和连接酶连接等流程构建重组质粒。这种方法可以得到完整的基因序列，扩增长度适中，利于后续操作。

基因合成是新技术中的一种，将目的基因序列按照设计合成，可克服PCR扩增和限制酶切不便的困境。基因合成的优势在于可以避免了PCR扩增过程中可能出现的错误引物或反向转录系统的不同导致的克隆失败的情况。

二、表达

表达是实现HisTag重组蛋白高效制备的关键步骤。表达系统根据基因来源不同，包括哺乳类、昆虫、真菌、细菌等多种类型。其中，细菌表达体系最为常用，主要包括大肠杆菌表达体系和其他细菌表达体系。

（1）大肠杆菌表达体系

大肠杆菌表达体系是最常用的表达系统之一。大肠杆菌能够快速生长，维护成本低且容易操作。该系统一般采用pET表达载体，其中包括T7启动子、启动子上游T7启动子和空载体、抗性标记等基本元件。基因的表达和过表达皆可通过不同激励剂的作用来实现，其中最常用的是IPTG（异丙硫代半乳糖醛）。

（2）其他细菌表达体系

除大肠杆菌之外，真核生物来源的HisTag重组蛋白在其他细菌表达体系中表达的效率也较高。

Biobrick是一种新颖的细菌表达体系，通过设计基因表达序列，避免了大肠杆菌表达时常见的一些问题。Biobrick表达体系在固定的表达序列中嵌入目的蛋白序列，在其上下游质粒中加入多种启动子，进一步增强目的蛋白的表达。

除了上述细菌表达外，还有酵母表达体系和豌豆球菌表达体系等。

三、亲和纯化

亲和纯化是纯化HisTag重组蛋白的一种广泛应用的方法，其基本原理是通过蛋白与金属离子配对的亲和性实现特异性分离。其中最为常用的是Ni-NTA亲和纯化和Co-NTA亲和纯化。

（1）Ni-NTA亲和纯化

Ni-NTA亲和纯化利用Ni2+与His标签之间的亲和性实现蛋白的选择性结合，并通过蛋白质电泳技术或其他方法检验目标蛋白纯度。使用该方法纯化的HisTag重组蛋白具有高纯度和高产量，适用于多种规模的分离和纯化。

（2）Co-NTA亲和纯化

Co-NTA亲和纯化是一种与Ni-NTA亲和纯化相似的方法，区别在于采用Co2+离子替代Ni2+离子。Co-NTA亲和纯化优点在于Co2+离子对His标签的亲和性较强，其吸附能力更强，并且不会对目标蛋白的活性产生影响。

四、总结

HisTag重组蛋白的基因克隆、表达和亲和纯化涉及到很多精细的实验步骤和技术细节。经过系统的操作操作和优化实验后，能够快速获得纯化度较高、产量较大的HisTag重组蛋白，为后续开展功能分析、药物筛选等研究奠定了坚实的基础。