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奥扎格雷对酪氨酸酶的抑制机理

摘要：奥扎格雷不仅能抑制酪氨酸酶单酚酶的活性，而且能够抑制酪氨酸酶二酚酶的活性。对单酚酶的抑制作用主要表现为抑制酶活，并且使得酶催化反应的延滞时间有明显的延长，而对二酚酶的抑制作用，主要表现为抑制二酚酶酶活。同时，讨论了酚氧化酶的催化氧化的机理：酶和底物结合后，会形成一个新的疏水性的“口袋”，抑制剂奥扎格雷会嵌入这个“口袋”，形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。

关键词：酪氨酸酶奥扎格雷单酚酶二酚酶抑制机理

中图分类号：Q356.1文献标识码：A文章编号：

1672-3791（2015）06（c）-0249-02

奥扎格雷（ozagrel）是一种新型抗血小板聚集药，药理研究表明，奥扎格雷能强力抑制TXA2合成酶的活性，从而抑制血小板聚集，同时提高前列环素PGI2的浓度，扩张血管，增加血流量，有效抑制脑血栓的形成，使已形成的血栓靠血液平衡关系的打破而被自行溶解，达到治疗脑梗塞之功效。该文研究了奥扎格雷对蘑菇酪氨酸酶的抑制动力学。该研究结果为进一步的设计高效酪氨酸酶抑制剂奠定理论基础，并为奥扎格雷及其衍生物作为食品防腐剂、果蔬保鲜剂以及美白化妆品的添加剂阐明了它们作用的酶学机理，为新型高效酪氨酸酶抑制剂的开发提供了新的分子模板。

1实验方法

1.1酪氨酸酶活力测定

酪氨酸酶单酚酶活力测定：1.5mmol/LL-酪氨酸为底物，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中，30^恒温10分钟，加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力测定：1.0mmol/LL-DOPA为底物，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中，30^恒温10分钟，加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。

2结果与讨论

2.1奥扎格雷对酪氨酸酶单酚酶的影响

如图1所示，奥扎格雷具有抑制蘑菇酪氨酸酶单酚酶酶活。测定不同浓度的奥扎格雷浓度对酪氨酸酶单酚酶作用的进程曲线，曲线1-5分别表示奥扎格雷在测酶活体系中的浓度为0、10、20、30和40mol/L。图1结果表明，奥扎格雷能延长酶反应的延滞时间（曲线的直线部分交于X轴的值），并随着奥扎格雷浓度的增大而延长。在相同反应时间下，反应体系的吸光度值随着奥扎格雷浓度的增大而下降，说明奥扎格雷对酪氨酸酶的单酚酶活性有抑制作用。延滞期过后，酶催化体系逐渐达到了稳态（曲线的直线部分）。相对抑制

率达到50%的奥扎格雷浓度（IC50）为1.35mmol/L。

2.2奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的影响

以L-DOPA为底物测定酪氨酸酶二酚酶酶活，反应进程曲线如图2（曲线0-5）。在测活条件体系中，加入酶液后，反应迅速进入稳态，产物与时间呈线性递增，直线部分为酶催化底物反应级数为一级反应，随着时间的延长，酶受到奥扎格雷的抑制，导致酶活下降，从而反应级数逐渐的由一级反应转变为零级反应。在不同的奥扎格雷浓度条件下，随着奥扎格雷浓度的增加，一级反应区域（曲线直线部分）的斜率逐渐减小，即奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶酶活的抑制程度增大。

2.3催化机理

在氧气存在条件下，酪氨酸酶的基本功能有两个：作为单酚酶羟基化单酚生成邻二酚（图3）；作为双酚酶氧化邻二酚生成醌（图4）。该酶具有包含两个铜离子位点的活性中心，并与不同数目的氧原子配位结合具有三种不同状态，分别为氧化态Eoxy，还原态Emet和脱氧态Edeoxy。氧化态Eoxy兼具单酚酶和二酚酶的活性；还原态Emet具有二酚酶的活性，不具有单酚酶活性，但是和单酚底物具有亲和作用，所以还原态Emet是延滞效应产生的原因；脱氧态Edeoxy的作用是只能结合氧。所以，酪氨酸酶催化单酚类底物都是从Eoxy开始，Emet和Edeoxy均不与单酚类底物反应，Eoxy

和Emet两者都可以催化多酚类底物。

奥扎格雷能够延长单酚酶的延滞时间，降低单酚酶和二酚酶的稳态速率，说明奥扎格雷能够可逆的抑制酪氨酸酶并阻止多巴色素的生成，进而能够遏制黑色素的生成。并且，对于二酚酶体系而言，奥扎格雷不仅能和还原态酶Emet和氧化态酶Eoxy结合分别形成对应的酶-抑制剂复合物Emetl和Eoxyl，而且还能和酶-底物复合物Emetl和Eoxyl分别形成对应的酶-底物-抑制剂复合物EmetSI和EoxySIo同时，根据奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的混合型抑制机理，这一过程可表示为：（如图5所示）

其中E（Emet，Edeoxy和Eoxy）、D、I和P分别表示酶的三种形态、底物L-DOPA、奥扎格雷和产物，EI、ES和ESI分别表示酶-抑制剂复合物、酶-底物复合物和酶-底物-抑制剂复合物。从酪氨酸酶角度分析，该酶存在两个结合位点，一个