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2021/3/26QPCR技术细节ppt课件1细节决定成败QPCR的技术细节对实验结果的影响2023最新整理收集do
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2021/3/26QPCR技术细节ppt课件2内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件3实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测荧光定量PCR原理
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件4扩增曲线荧光阈值Ct值荧光定量PCR原理
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件5在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。PCR产物的积累规律
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件6PCR产物的积累规律示意图
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件7荧光定量PCR定量原理扩增曲线
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件8荧光定量PCR定量原理为什么终点定量不准确呢？
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件9荧光定量PCR定量原理尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cyclethreshold）与模板起始浓度有密切联系。
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件10Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数Cycle（循环数）Rn（荧光强度）Ctvalue荧光定量PCR原理－－Ct值
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件11前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline）荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过阈值荧光定量PCR原理－－荧光阈值
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件12定量PCR的数学原理
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件13定量PCR的数学原理
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件14定量PCR的数学原理
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件15定量PCR的数学原理CyclenumberCk104Ck102SampleLogofDNAconcentration模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件16线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认NoTemplateControl(NTC)确认PCR扩增效率（E）:0.9-1.135Cycles内可得到好的定量结果如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增35Cycles内无引物二聚体产生相关系数（r2）：大于0.98荧光定量PCR反应性的确认
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件17内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的标记方法实验流程及注意事项荧光定量PCR解析方法
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件18非特异性荧光标记SYBRGreenI特异性荧光标记TaqManProbe常用荧光标记方法
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件19SYBRGreenI染料法——原理SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件20热变性引物退火延伸反应SYBRGreenI染料法——作用机理
2021/3/26QPCR技术细节ppt课件21问题点：SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测到，从而可能导致检
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