引物设计心得、Primer5.0-使用.docVIP

引物设计、选择核酸内切酶、酶切位点之Primer5.0使用

下面以目的基因CD63为例，介绍一下真核表达载体PcDNA3.1(+)-CD63的构建过程

1cd63基因序列的获取

翻开NCBI-选择

输入cd63回车

找到第16条编码为1的

翻开后可见该积基因的详细信息，找到CDS〔编码序列〕

可见其编码序列为第146到862位碱基，继续往下拉，可见基因序列，选中编码序列〔146-862〕复制，翻开Primer5.0

〔起始密码子〕ATGgcggtggaaggaggaatgaagtgtgtcaagtt

181tttgctctacgttctcctgctggccttctgcgcctgtgcagtgggattgatcgccattgg

241tgtagcggttcaggttgtcttgaagcaggccattacccatgagactactgctggctcgct

301gttgcctgtggtcatcattgcagtgggtgccttcctcttcctggtggcctttgtgggctg

361ctgtggggcctgcaaggagaactactgtctcatgattacatttgccatcttcctgtctct

421tatcatgcttgtggaggtggctgtggccattgctggctatgtgtttagagaccaggtgaa

481gtcagagtttaataaaagcttccagcagcagatgcagaattaccttaaagacaacaaaac

541agccactattttggacaaattgcagaaagaaaataactgctgtggagcttctaactacac

601agactgggaaaacatccccggcatggccaaggacagagtccccgattcttgctgcatcaa

661cataactgtgggctgtgggaatgatttcaaggaatccactatccatacccagggctgcgt

721ggagactatagcaatatggctaaggaagaacatactgctggtggctgcagcggccctggg

781cattgcttttgtggaggtcttgggaattatcttctcctgctgtctggtgaagagtattcg

841aagtggctatgaagtaatgtag其中tag〔〔UAG〕终止密码子，设计引物的时候需要将其删除，因为，真核表达载体上多含有标签序列，目的基因与载体链接后，在目的基因的下游即为标签序列，如果不去除上述终止密码子，那么目的基因转录的时候就会在此终止，标签序列就不会得到表达，为后续帅选阳性克隆等实验带来困难！

点击file-new-DNAsequence-将编码序列复制〔ctrlV〕

选择Asis

2限制性内切酶的选择

通过查看PcDNA3.1〔+〕载体图谱，选择适宜的内切酶，筛选的标准是，目的基因序列内不存在该酶的酶切位点，以及选择实验室内常用的已有的酶。

另外pcDNA3.1〔+〕，和〔-〕的含义是都是多克隆载体，只是多克隆位点区有差异，应用都是一样的，都可以做真核表达

我们可知载体上存在这些酶切位点

结合本实验室拥有哪些常用的酶选择适宜的两个酶

科技楼常用BamHI、XhoI、HindIII、EcoRI、PstI、BgiII这几种酶，所以尽量选择这几种，以便省去买那些不常用的酶，造成浪费

下面看

点击Enzyme，将刚刚我们列出的几种酶从左面导入到右面，点击OK

出现

PstI这种酶在目的基因内部第625个碱基出存在酶切位点，那么该酶不能使用，我们可以从BamHI、XhoI、HindIII、EcoRI、BgiII中选择两个，两个酶切位点之间相距不要太近，以免因为空间位阻影响酶的切割效率，上图左边为上游酶切位点，右面为下游酶切位点，上下游各选择一个，故我们可以选择HindIII和XhoI、BamHI和XhoI、HindIII和XhoI几种组合，又因为每种酶发挥效能时需要适宜的液体环境，即Buffer，我们尽量选择两种酶都能正常使用的Buffer，见下表：

我们选择了HindIII和XhoI，查表可知应选用1×MBuffer

这样酶切位点和酶，buffer都选好了，下面开始设计引物

3引物设计

点击Primer-左上角file-preference