生物化学大实验报告.docVIP

生物化学大实验报告

——谌星生物学（基地）

【摘要】碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称，它的作用是催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5-Pi末端转换成5-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。细菌碱性磷酸酶（BAP）是一种从大肠杆菌中分离纯化而来的一种酶，是分子生物学中常用的一种工具酶，它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,为了了解并掌握蛋白分离与纯化以及相关性质，进行了生物化学大实验的操作，涉及到SDS检测表达蛋白、蛋白质印迹、亲和层析纯化、离子交换层析纯化、分子筛排层析测定活性BAP的蛋白质分子量以及BAP活力与比活力的测定。

关键词：细菌碱性磷酸酶分离纯化

一、材料与方法

1.1研究对象

本次选择的细菌为BL21大肠杆菌工程菌株，外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D—半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。

1.2研究内容

1.2.1分子筛排阻层析测定活性BAP的蛋白质分子量

首先是凝胶处理，然后是装柱、联机、上样、标准曲线的制作和目的蛋白分子量测定

1.2.2离子交换层析纯化

通过亲和柱纯化后的样品可再通过离子交换层析进行纯化。先是装柱，然后上样、洗脱及收集，再使离子交换柱再生。

1.2.3亲和层析纯化

亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使酶等生物分子分离纯化的技术。

（1）.过夜BL菌以1:50扩培比进行扩培，至OD600＝0.5，需190r/min约1h20min，然后加入IPTG至终浓度为1mM，于28°C，160r/min-190r/min条件下诱导5h。

（2）.诱导表达后的菌体5000r/min离心15min，弃去LB培养基。按10:1体积比重悬于破碎缓冲液中（即startingbuffer），5000r/min离心10min，弃上清，加入破碎缓冲液以及终浓度为1mg/mL的溶菌酶，30℃温浴15min。

（3）.冰浴条件下，60％功率超声处理5min，超声4sec间隔12sec；再用40％功率超声处理5min，超声4sec间隔12sec。（超声要求：a.将菌液处理至清亮；b.始终保持低温环境；c.避免出现黑色沉淀）。

（4）.将超声处理后的样品于4℃2000r/min离心10min，沉淀为细胞碎片，弃去。再于4℃12000r/min离心10min，上清为可溶性蛋白，沉淀即为包涵体。（如需纯化包涵体蛋白，沉淀可用破碎缓冲液冲洗两次，将1mL裂解液对应的包涵体溶于500?L8M/L尿素中）。将上清再次于4℃12000r/min离心10min，进一步除去杂质。除用于亲和层析纯化外，于4°C保存至少1mL可溶性蛋白粗提液用于碱性磷酸酶活力和比活力。

（5）.镍柱亲和层析纯化可溶性蛋白：

=1\*GB3①将亲和层析介质用5柱体积灭菌超纯水冲洗；

=2\*GB3②用5柱体积startingbuffer进行平衡柱子；

=3\*GB3③将5-10mL的可溶性蛋白样品上柱，并可反复过柱2-3次；

=4\*GB3④用含30mM咪唑的washbuffer冲洗约10-12柱体积；

=5\*GB3⑤用3mL含有300Mm咪唑的elutionbuffer洗脱目的蛋白，每500?L收集1管（为增加洗脱效率，每收集500?L后可用elutionbuffer孵育柱子5min）；

=6\*GB3⑥SDS－PAGE检测蛋白纯化效果；

1.2.4SDS检测表达蛋白

蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，且具有相似的形状，在电场下，按相对分子质量大小在凝胶胶上排列。蛋白条带经考马斯亮蓝R250染色后形成肉眼可见的蓝色条带，并可用凝胶成像系统分析条带蛋白含量和相对分子质量。首先，配制分离胶，再配制5%浓缩胶，然后电泳，将电板从电池槽中取出，在凝胶成像系统中分析特异条带的位置和分子量。

1.2.5蛋白质印迹

印迹法一般由凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。

=1\*GB3①取出凝胶，切去浓缩胶，分离胶也可以做适当裁减（电泳时最好使用预染Marker这样在以后可以检查转移效率）。用灭菌去离子水冲洗，然后放入转移缓冲