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B3Z系统的抗原交叉呈递实验

实验原理

外源性的抗原在一些分子的辅助下，进入抗原呈递细胞中，在APC中经过加工，形成抗原肽表位，与MHCI类分子结合形成复合物，呈递到细胞表面，供T细胞的受体TCR识别，传递信号，活化T细胞，发挥功能。该实验利用K41捕获外源性抗原OVA20，进入细胞后，加工成H-2Kb限制性表位SIINFEKL(OVA8)，与MHCI类分子形成复合物，呈递到细胞表面，当B3Z细胞受体TCR识别后，激活β-半乳糖苷酶，加入CPRG底物，会使其黄色变为红色的CPR(在577nm处吸收)，则说明外源性抗原通过MHCI类分子途径交叉呈递。原理示意图如下：

实验材料

细胞：K41细胞是小鼠成纤维母细胞（H-2b），是贴壁细胞，细胞呈纤维状，在含有10%的胎牛血清和100U/mL的链霉素/青霉素的RPMI1640中培养。能够加工OVA20肽，OVA20肽中含有H-2Kb限制性表位SIINFEKL(OVA8)，形成H-2Kb/OVA8复合物，呈递到细胞表面。

B3Z细胞是CD8+T杂交瘤细胞株，是OVA257-264特异性的，该细胞是悬浮生长的（多次复苏后要么就慢慢死掉，要么就贴壁生长了，而且贴壁生长的还不错，但是流式检测贴壁生长细胞的CD8不表达），该T细胞受体TCR识别H-2Kb/OVA8复合物，使T细胞合成β-半乳糖苷酶。

CPRG缓冲液：0.12mMChlorophenolred-beta-D-galactopyranoside（氯酚红-β-D-半乳糖苷，CPRG）；100mMβ-巯基乙醇，9mMMgCl2，0.125%NP-40。全部用PBS配制。其中CPRG是提供底物，如果T细胞活化，会激活半乳糖苷酶，进而催化水解CPRG变成氯酚红(CPR)。β-巯基乙醇作为还原剂可以打开二硫键，破坏膜结构，进而使半乳糖苷酶释放出来，发挥作用。MgCl2中Mg2+可以作为酶的激活剂。NP-40是一种裂解液，破环细胞膜，同时抑制蛋白质的降解。

终止液：300mM甘氨酸，15mMEDTA，用水配制。

实验方法

（1）、将一些辅助分子（这里以热休克蛋白gp96为例）与OVA20肽混合，先放在50摄氏度孵育10min，使gp96结构打开，与肽结合，然后室温静置30min，使结构闭合，形成复合物。

（2）、K41细胞计数，用预热的RPMI1640缓冲液洗两遍，使用96孔平底板（为了细胞与复合物更好的接触），每孔10w个细胞/100μL，放到培养箱中培养0.5-1h，使细胞贴壁生长，然后加入合适浓度的复合物，放在37℃含有5%CO2的培养箱中0.5-1h。

（3）、B3Z细胞计数，调整个数为1×106/mL，吸取100μL细胞悬浮液加入到K41-复合物中，共孵育过夜。

（4）、第二天配制CPRG缓冲液，先用PBS洗涤2次（倒去上清要轻点），然后加入100μLCPRG显色液，37℃放置4h。

（5）、显色期间观察颜色变化，对照组红色很明显，就可以终止反应，加入50μL终止液，然后放在酶标板下OD570读数。