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划重点！NGS中DNA建库方法全面解析

高通量测序技术的飞速发展，测序通量大幅增加，要求上游样本

处理尽可能简单快速，以提高NGS整个流程的工作效率。文库构建，

尤其是DNA文库构建是二代测序建库技术的基础，其他的建库方法都

以该方法为基础发展而来。DNA建库方法是分子生物学的实验原理，

其本质就是在待测片段两端加上接头的过程，目前DNA建库方法按照

接头连接方式不同可分为五类：

●TA克隆连接接头建库

●Swift法建库

●转座酶法建库

●PCR扩增子建库

●平末端连接接头建库

一TA克隆连接接头建库

TA克隆连接接头建库是目前应用最广泛的建库技术，简单描述就

是：将提取好的DNA片段化，在进行末端修复和加A尾，然后连接上

接头（adapter），最后通过PCR扩增（可选），中间再穿插着纯化/

分选步骤就完成了文库的构建。在这里，提前合成好的带T尾接头和

末端带A的目的片段在DNA连接酶的作用下通过TA克隆方式连接

（图1）。

图1.TA克隆连接接头建库法流程图

TA克隆连接接头可以有效保留样本几乎所有基因组信息，非常有

利于未知拷贝数的和基因组变异的检测，是全基因组测序和外显子测

序的主要建库手段，目前市面上有很多试剂盒供应，直接应用试剂盒

建库，操作简单，2.5-3.5h就可获得稳定高品质文库。

二Swift法建库

Swift建库方案是SwiftBioSciences公司独有的NGS建库技术，

基本步骤与TA克隆连接接头建库方法类似，是由TA克隆连接接头的

方法发展而来。主要通过两步法在插入片段两端引入P5和P7接头序

，，

列，末端修复之后，先在3端连接带P7的接头，再在5端连接带P5

的接头，最后通过PCR扩增（可选）完成文库构建（见图3）。Swift

法建库主要宣传优势是文库转化效率高，特别是针对cfDNA样本的建

库实验。但此方法操作比较繁琐，新手很难达到其官方宣传的建库效

率。

图2.Swift法建库流程图

三转座酶法建库

转座酶法建库技术的核心是Tn5转座子，Tn5转座子是一段含有

若干抗性基因和编辑转座酶基因的DNA片段，是一种细菌转座子，最

早在大肠杆菌中发现。NGS文库构建即把DNA样本片段化或筛分成

指定长度的目标序列，再加上寡核苷酸接头P5、P7（和条形码

Barcode），用于后续测序上机。传统建库方式需经过DNA片段化、

末端修复、接头连接、文库扩增、多次纯化分选等步骤，耗时较长，

将Tn5用于测序文库构建时，可将DNA片段化、末端修复、接头连接

等多步反应转变为1步反应，极大缩短建库时间，提高工作效率。

Tn5用于NGS建库的体外转座要素包含：转座子的末端序列、靶

DNA、转座酶（Tnp）和Mg2+（激活剂），转座法建库形成的文库结

构如下：

图3.转座法建库文库结构

将P5、P7端部分接头序列（Adapter1/2）+转座子末端序列设

计合成供体DNA，Tnp识别转座子末端形成带有P5、P7端部分接头

的Tn5转座复合体（见下图4）。该复合体识别受体DNA的靶序列

（Targetsite），切断受体DNA，并插入携带的供体DNA，形成一端

带有P5部分接头Adapter