重组DNA-分子克隆技术课件.pptVIP

重组DNA-分子克隆技术5.免疫学方法利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。包括：免疫化学方法、酶免检测法放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+第6步：克隆基因的表达1.表达载体的选择和构建2.受体细胞的建立和转化3.目的基因的表达及检测4.表达产物的分离和纯化5.表达产物的应用1.表达载体的选择和构建（1）表达载体的选择①原核表达体系大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，运用大肠杆菌表达载体符合下述标准：※含大肠杆菌适宜的选择标志※具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子※含适当的翻译控制序列和翻译起始点等※含有合理设计的多接头克隆位点，以确保目的基因按一定方向与载体正确衔接表达产物的分离、纯化。大肠杆菌表达体系中尚有一些不足之处：※由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因组DNA※由于缺乏适当的翻译后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰※表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理※很难表达大量的可溶性蛋白。2．真核表达体系与原核表达体系比较，真核表达体系如酵母、昆虫、哺乳类动物细胞表达体系显示了较大优势性。尤其是哺乳类动物细胞