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微生物的生理生化反应

一、实验目的

1.掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的测定方法。

2.了解细菌代谢类型的多样性。

3.了解细菌生长现象及代谢产物在鉴别中的意义。

4.学习接种技术。

二、实验原理

在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微

生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因

此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。

1.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能

源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸

等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产

气。产酸后再加入溴甲酚紫指示剂后会使溶液呈黄色，且杜氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使

糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且杜氏小管中无气体。

2.甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，

乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色，即甲

基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。

3.伏-普试验（VP）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成非酸性或中性末端产物，某些细菌产生

丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被氧化成二乙酰，二乙酰与胍基作用，生成

红色化合物，为阳性。

4.靛基质（吲哚）试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可

将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所

有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆

菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。

5.硫化氢实验：某些细菌分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫酸铵亚铁等铁盐可与硫化氢反应生成不

溶性硫化亚铁之黑色沉淀，为硫化氢实验阳性。

6.明胶液化实验：明胶液化试验是利用某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，

从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体这样的原理进行的实验方法。

7.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质

分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至

细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇，碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀

粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透

明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。

8.柠檬酸盐利用实验：柠檬酸盐培养是综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵

是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分

解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。

不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。

三、实验器材

1.实验仪器：32℃培养箱，灭菌锅等

2.微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、未知菌种s1ors2

3.试剂：甲基红试剂、V.P.试剂、吲哚试剂

4.实验用具：各生化反应培养基（3支/小组/实验，1支对照/大组/实验,1淀粉培养基/小组），酒精灯、

接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、杜氏小管等。

四、实验步骤

1.培养基准备：分组准备各生化反应培养基

（1）葡萄糖/乳糖发酵培养基（用于葡萄糖发酵实验）

蛋白胨10g

NaCl2.5g

水500ml

制法：

①将上述成分混合于蒸馏水中加热溶解，调整pH至7.4—7.6。

②加葡萄糖/乳糖5g，加热溶解后加入0.5ml的1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，混匀。

③配好的培养基分装到试管中，每支5ml。内倒置配排净空气的杜氏小管，0.06MPa、30min灭菌。

（2）葡萄糖蛋白胨水培养基（用于甲基红和伏-普实验）

蛋白胨2.5g

葡萄糖