B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基因反式激活能力的比较.pdfVIP

B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白对MDR1基

因反式激活能力的比较

【摘要】目的研究B、C基因型乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白对多药

耐药基因1(MDR1)反式激活能力的差别。方法PCR扩增B、C基因型HBV

X基因并克隆于pcDNA3.1/HisC载体(重组载体分别为pcDNA3.1/HisC

XB及pcDNA3.1/HisCXC)。以FuGENE6将重组表达载体转染HepG2

细胞,采用融合表达的Xpress多肽表位抗体,通过Westernblot

检测目的蛋白在不同时间段的表达。PCR扩增MDR1基因启动子并克隆

于萤火虫荧光素酶报告载体pGL3Basic(重组载体为pGLMDR)。

pGLMDR分别与pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisCXC共转

染HepG2细胞,转染后48h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性。

实验数据以SPSS11.5软件分析。结果成功克隆X蛋白表达载体及MDR1

报告载体。Westernblot显示pcDNA3.1/HisCXB或pcDNA3.1/HisC

XC在HepG2细胞中均能表达HBVX蛋白,以转染后48h为最高。当

pGLMDR报告质粒与X基因重组载体或空载体质量比在1∶2~1∶4

范围内,萤火虫荧光素酶在各转染细胞内的活性依次为

pcDNA3.1/HisCXB+pGLMDR组gt;pcDNA3.1/HisCXC+pGL

MDR组gt;pcDNA3.1/HisC+pGLMDR组(对照组),且存在剂量效应

关系。结论B、C基因型HBVX蛋白对多药耐药基因均有反式激活能力,

且B基因型强于C基因型。

【关键词】肝炎病毒乙型癌肝细胞基因病毒反式激活（遗

1

传学）病毒蛋白质类基因MDR药物耐受性

X蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)最重要的致病因子之一,可反式激

活多药耐药基因1(multidrugresisitancegene1,MDR1)[1],与HBV

相关性原发性肝细胞癌(primaryhepatocellularcarcinoma,HCC)的

高度恶性化及对化疗药物高度不敏感有关。研究表明B、C基因型HBV

相关性HCC患者的临床表现及病理改变具有明显差别,而B、C基因型

HBVX蛋白功能存在差异[24]。本研究拟通过分析B、C基因型HBV

X蛋白对MDR1基因反式激活能力的差异,进一步探讨HBV基因型与致

病性的相互关系。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1HBVDNA及肝细胞株pUC18XB(含B基因型HBVX基因的

pUC18重组载体)及pUC18XC(含C基因型HBVX基因的pUC18重组

载体)为本室保存。HepG2肝癌细胞株(美国组织细胞库,ATCC)。

1.1.2主要试剂DMEM培养基、DNAzol、胎牛血清、Westernbreeze

试剂盒、AntiXpress抗体、pcDNA3.1/HisC(美国Invitrogen公

司);ExpandHighFidelityPCRKit、FuGENE6(美国Roche公司);phRL

2

SV40,pGL3basic(美国Promega公司);质粒大量抽提试剂盒(美

国Qiagen公司);Braford蛋白检测试剂盒(美国Bio