基因操作的主要技术原理.pptVIP

第62页，课件共112页，创作于2023年2月NorthernBlotting相对Southernblotting命名的，与Southernblotting不同的是，它检测的对象是RNA分子。第63页，课件共112页，创作于2023年2月第64页，课件共112页，创作于2023年2月第65页，课件共112页，创作于2023年2月WesternBlotting杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从SDS中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检测主要用于基因的表达产物蛋白质的检测第66页，课件共112页，创作于2023年2月第67页，课件共112页，创作于2023年2月第68页，课件共112页，创作于2023年2月第五节PCR技术第69页，课件共112页，创作于2023年2月一、PCR技术的基本原理Polymerasechainreaction,PCR聚合酶链式反应AmethodforamplifyingspecificDNAsegmentsthatexploitscertainfeaturesofDNAreplication.第70页，课件共112页，创作于2023年2月一个DNA经n次扩增后,一个DNA分子可变为2n理论上经过30次循环，靶DNA得到109倍的扩增，实际是106~7倍的扩增DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物第71页，课件共112页，创作于2023年2月二、PCR反应的各种组份及作用第72页，课件共112页，创作于2023年2月一个标准的PCR反应体系（50~100μl）50mmol/LKCl10mmol/LTris-HCl（pH=8.4）1.5mmol/LMgCl2100μg/ml明胶或牛血清白蛋白（BSA）2个引物，各0.25μmol/LdNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP）各200μmol/L模板DNA（人基因组DNA）0.1~1μgTaqDNA聚合酶2U第73页，课件共112页，创作于2023年2月Denaturation94℃,0.5minPrimerannealing55℃,1.5mionExtension72℃,1min30cycles变性（模板）－退火（引物与模板）－延伸（新合成DNA链）第74页，课件共112页，创作于2023年2月1.模板DNA用于PCR扩增的模板DNA通常是从细胞中提取的染色体DNA，它们并不需要高度纯化。待扩增的靶DNA的长度在3kb以下是PCR的有效扩增范围，采用经改造的TaqDNA聚合酶可扩增出40kb的DNA片段。第75页，课件共112页，创作于2023年2月2.引物PCR引物是与待扩增的目的DNA两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段引物的长度通常为17~30个核苷酸引物太短，可能同非靶DNA杂交，得出非预期的扩增产物；引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响扩增效率。第76页，课件共112页，创作于2023年2月如8nt的引物，平均每48=65536bp就会有一个结合位点，在全长为3×109bp的人类基因组中，大约有43000个可能的结合位点，不能得到单一的特异性扩增产物。如为17nt的引物，出现几率为417=17,179,869,184bp，长度超过人类基因组长度的5倍，故在人类基因组中只可能有一个结合位点。但引物不是越长越好，过长的引物同模板DNA的杂交效率反而下降，从而降低PCR反应的效率。第77页，课件共112页，创作于2023年2月简并引物是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷酸序列。第78页，课件共112页，创作于2023年2月引物与复性温度引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的DNA片段被扩增复性温度过高，引物与模板不能配对复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些Tm=4×(G＋C)＋2×(A＋T)℃1~2℃below第79页，课件共112页，创作于2023年2月第30页，