SN 1418-2004鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验.docxVIP

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准

SN/T1418—2004

鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验

SerumneutralizationtestforduckvirushepatitistypeIvirus

2004-06-01发布

2004-12-01实施

中华人民共和：国

国家质量监督检验检疫总局

发布

I

SN/T1418—2004

前言

本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。

本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。

本标准主要起草人；陈琨、黄新民、徐海聂、杨素、潘文波、廖秀云，

本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。

SN/T1418—2004

鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验

1范围

本标准规定了鸭病毒性肝炎I型病毒血清中和试验操作方法。

本标准适用于检测血清中的鸭病毒性肝炎I型病毒抗体。主要用于鸭病毒性肝炎的诊断及病原鉴定、免疫水平的监测和流行病学调查。

2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

2.1

BME:EaglesBasalMedium细胞基础盐培养基。

2.2

CPE:细胞病变。

2.3

DEK:鸭胚肾细胞。

2.4

DEL:鸭胚肝细胞。

2.5

DHV-I:鸭病毒性肝炎I型病毒。

2.6

FCS:胎牛血清。

2.7

MEM:EaglesMinimalEssentialMedium细胞培养基.

2.8

PFU:空斑形成单位。

2.9

TCID:半数细胞培养感染量。

3原理

病毒感染敏感的细胞单层后，可以在细胞单层上生长增殖，并能产生CPE,使感染细胞圆缩、坏死并形成空斑，血清中的特异性抗体能够抑制病毒在细胞单层上生长，血清抗体中和病毒的能力可以通过其阻止CPE产生的程度加以测定。本中和试验是应用固定病毒量稀释血清的方法，在DEL或DEK细

胞单层上进行中和试验，用于鸭血清抗体的测定或病原的鉴定。

4仪器设备

4.1高压蒸气灭菌器。

4.2可调移液器。

4.3二氧化碳恒温培养箱。

4.4倒置显微镜。

4.5除菌过滤器。

2

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5材料准备

5.1鸭病毒性肝炎I型病毒。

5.2抗鸭病毒性肝炎I型病毒的阴、阳性血清，使用前均以56℃灭能30min后备用。

5.3受检血清按常规方法采血并分离血清，使用前均以56℃灭能30min后备用。

5.4溶液的配制：见附录A。

5.5细胞培养板：选用无菌的孔径为5cm平底带盖塑料培养皿，或96孔平底带盖塑料培养板。

5.6其他仪器：如剪刀、镊子、平皿、烧杯、三角瓶、刻度离心管、注射器、吸头等以112kPa高压灭菌30min,烘干后备用。

5.7DEL细胞单层的准备：参见第B.1章。

5.8DEK细胞悬液的准备：参见第B.2章。

6血清中和空斑减数试验

6.1病毒毒价测定及配备

取DHV-I用维持液将病毒液作10倍系列稀释，每个稀释度接种三个培养皿，按7.2.4和7.2.5的方法进行试验。取每个稀释度的三个培养皿的空斑平均数，用Reed-Muench法计算病毒的PFU量，

使用前配制成含200PFU/0.1mL的病毒悬液备用。

6.2操作步骤

6.2.1血清稀释及中和感作：分别取阳性血清、阴性血清、受检血清样品，用维持液作两倍系列稀释，每个稀释度加入等量病毒悬液，然后置37℃中和感作60min,每个稀释度接种三个培养皿。

6.2.2细胞对照：设三个培养皿的正常细胞对照，加入维持液。

6.2.3病毒对照：设三个培养皿的病毒对照，将上述使用的病毒悬液稀释为100PFU/0.1mL。

6.2.4取已长满DEL细胞单层的细胞培养皿，吸去培养液，用维持液清洗两次，将上述稀释及感作好的混合液移人细胞培养皿内，每个培养皿0.1mL,加盖后轻轻摇，使液体均匀分布于DEL细胞单层表面，然后置室温(20℃~22℃)感作30min。

6.2.5每培养皿加人琼脂维持液3mL,加盖后，置37℃、3%～5%二氧化碳培养箱培养48h,取出后用偏光源(或低倍倒置显微镜)直接观察空斑的形成情况，或用10%的福尔马林固定后用1%的结晶紫染色观察空斑，并记录形成空斑的数量。

6.3结果判定

6.3.1当细胞对照正常，阳性血清效价与原滴定的效价相差1个滴度以内，病毒对照的三个培养皿的平均空斑数误差在10PFU以内时整个试验有效。

6.3.2