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粪便中芽孢杆菌的分离和鉴定
一、实验原理:通过对粪便的处理,对其进行细菌分离,选择出芽孢杆菌。芽孢杆菌多为革
兰氏阳性菌,需氧或者兼性厌氧。通过普通培养基进行细菌培养,观察其菌落的形态、特征。
对典型的菌落进行革兰氏染色和芽孢染色。之后进行普通培养基、血琼脂培养基、固体培养
基培养。之后进行过氧化氢、VP实验、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、甲基红实
验、吲哚产生实验、苯丙氨酸脱酸实验、葡萄糖的水解实验、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、乳
糖的分解实验、液化明胶实验、硫铵水解实验等生理生化实验。对细菌进行16srDNA序列
测序,测GC碱基的所占比例、PCR测序,确定具体为何种芽孢杆菌,最后进行小鼠毒性实
验。
二、实验材料
粪便
锥形瓶、烧杯、载玻片、玻璃棒、胶头滴管玻、璃珠、培养皿、移液管、移液枪及枪头
小试管、试管、细玻璃棒、接种环、接种针、搪瓷缸、
水浴锅、纱布、冰箱、摇床、酒精灯、蒸馏水、无菌水、恒温培养箱、高压锅、电炉、pH
试纸、PH计
吸水纸、显微镜、秒表、天平、电子称、电子天平、温度计、记号笔、滤纸、塞子、纱布、
冰箱PCR仪、微量移液器、一次性手套、小鼠、手术刀、注射器
草酸铵结晶紫溶液、碘液、石碳酸溶液、95%酒精、碱性美蓝溶液、3%过氧化氢溶液、肌
酸/肌酐、40%氢氧化钾、无菌羊血清、3%淀粉溶液、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼
脂、磷酸一氢钾、氯化钠、溴麝香草酚蓝酒精溶液、硝酸钾、蛋白胨、1%氢氧化钠、对氨
基苯磺酸、5mol/L醋酸、α-萘胺、脱脂棉、二苯胺、浓硫酸、葡萄糖、、甲基红溶液、DL-
苯丙氨酸、酵母浸液、10%氯化铁、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、甘露醇、0.2%
溴麝香草酚蓝水溶液、1%溴麝香草酚蓝水溶液、HL-葡萄糖培养管、硫胨、牛肉膏、明胶、、
对位二甲氨基苯甲醛、无水乙醇、青霉素、
反应缓冲液、2mM脱氧核苷三磷酸底物、耐热DNA聚合酶、
三、实验步骤
3.1粪便的处理;取样品1g,加至带玻璃珠的含100mL无菌水的锥形瓶中,静置20min后,
在摇床上20r/min充分振荡30min,将样品液于80℃水浴15min,取10mL样品液均匀涂布
在制备好的普通营养琼脂平板上,37℃过夜培养
3.1.1普通肉汤培养基
配方:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL
配制:按上述要求称量(先称盐类、蛋白胨、牛肉膏),至于铝锅或者搪瓷缸;
将上述成分混合加热溶解后,以0.1mol/L氢氧化钠调整PH为7.4~7.6
3.1.2普通琼脂培养基的制作
配方:普通肉汤500ml(牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾、蒸馏水)、琼脂10g
(在液体培养基加入琼脂1.5%~2%为固体培养基、加入0.3~0.5%为半固体培养基)
配制:
1)将称好的琼脂加到普通肉汤内,加热煮沸待琼脂完全融化,分装试管或用于制
备琼脂平板。分装试管每管约4~5ml。分装完毕塞好棉塞,包扎好待灭菌。
2)高压蒸汽灭菌后,趁热将试管口的一端放在玻璃棒上,使之有一定的浓度,凝固
后即成普通琼脂斜面。也可直立,凝固后即成高层琼脂。
3)剩余部分的普通琼脂以手掌感触,若将琼脂瓶紧紧手中感觉烫,但仍能紧握时,
即为倾倒平皿的合适温度(50~60℃).每只灭菌培养皿倒入10~15ml,将培养皿盖上,并将
培养皿于桌面上轻轻回转,使培养皿平铺于皿底,即成普通琼脂平板。
3.1.3鲜血琼脂培养基的制备
1)将灭菌的普通琼脂培养基加热融化,待冷却至50℃,加入无菌的脱纤绵羊或者
家兔的鲜血5%~6%混合后,分装灭菌试管,立即摆成斜面或者倾注于灭菌平皿(琼脂温度
过高加入后为紫褐色,过低时鲜血加入不凝固,不易混合。混合时切勿产生气泡)。待凝固
后,至37℃无菌检验24h,无杂菌生长方可应用。
2)无菌血液采用无菌操作采自健康动物,将血液加到盛有5%灭菌枸橼酸钠或者
3%灭菌肝素的100ml三角瓶内,至冰箱待用。
3.2细菌的分离:
将上清液接种于营养肉汤,37℃,200r/min培养24h,,取培养液80℃水浴15min,杀死
非芽孢杆菌,接种于营养肉汤,37℃,200r/mi
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