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人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达(一)

【摘要】目的:制备人核迁移蛋白（hNudC)的单克隆抗体（mAb）并鉴

定其特性。方法:从人胎肝组织中克隆得到hNudC基因,构建重组表达质

粒表达带有标记的重组hNudC,用纯化的重组

hNudC蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb,用ELISA筛选抗体阳性的细胞克

隆,用免疫荧光染色法及Westernblot试验鉴定mAb的特异性。结果:获

得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为

IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;

腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。mAb与重组hNudC蛋

白有较强的特异性反应,免疫荧光染色和Westernblot试验证明,制备的

mAb可以识别人巨核系白血病细胞株Dami、和人脐带血来源

的CD41＋巨核细胞中表达的hNudC蛋白。结论:成功地制备了特异性

抗hNudCmAb,为研究hNudC蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了

基础。

【关键词】人核迁移蛋白;单克隆抗体;巨核细胞

人核迁移蛋白C基因(humannucleardistributionC,hNudC),定位于第1号

染色体编码331个氨基酸,基因全长为8kb。NudC进化上保

守,从构巢曲霉、果蝇、小鼠等生物均能找到同源物,人类NudC羧基末

端的94个氨基酸与构巢曲霉的同源性为67%,与果蝇的同源性为76%,

与大鼠的同源性为98%。NudC的末端12个氨基酸,在所有的种类

中都被保留〔1〕。hNudC在人体组织中广泛表达,提示hNudC具有重要

的生物学功能〔2〕。早期的生物学活性的研究表明,hNudC与其家族成

员(包括胞质动力蛋白、肌动蛋白、LIS1和NUDE)相互作用,和微管一起

参与细胞增殖〔3〕、正常的造血〔4〕、神经细胞形成等。近期研究进

一步证明,hNudC在促进造血细胞生长中起着功能性作用〔5〕。这些资

料为hNudC的功能研究提供了新的方向。

为了进一步研究hNudC蛋白的结构与功能,探索hNudC对于造血细胞的

增殖、分裂的功能和影响,迫切需要hNudC的特异性抗体,但现在并无相

应市售抗体。为此,本研究拟用纯化的重组hNudC蛋白为免疫原,利用经

典的淋巴细胞融合技术,建立稳定分泌特异性单克隆抗体(mAb)的杂交

瘤细胞株,并对得到的mAb进行鉴定,检测hNudC蛋白在人巨核细胞中

的表达情况和亚细胞定位,为进一步探讨hNudC蛋白的结构和功能提供

工具。

1材料和方法

1.1材料弗氏完全佐剂购于Sigma公司。蛋白表达载体pET28b(+)购自

Invitrogen公司;工具酶购自MBIFermentas公司;质粒DNA提取试剂盒和

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega公司;亲和层析柱

TALONSpinColumn购自CLONTECH公司;DynalCD34祖细胞分选系统

Prod.No.113.01购自DynalBiotech,Norway公司。造血干细胞无血清培

养液StemSpanH2000购自StemCellTechnologies公司;淋巴细胞分离液

购自AmershamBiosciences公司。

IMDM(Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium)培养基粉末:购自Gibco公司;

胎牛血清FBS购自Gibco公司。重组人的rhTPO购自于Sigma公司。FITC

标记的CD41mAb、藻红蛋白（PE）标记的二抗兔抗鼠（H+L）、FITC

标记的二抗兔抗鼠（H+L）等抗体购