冻存与复苏技术.pptx

细胞的冻存随着细胞培养技术的不断发展,各种细胞系如干细胞系和肿瘤细胞系等的开发与建系越来越引起研究工作者的重视。为了保种和长期维持培养细胞的活性与遗传性状稳定,以及避免因长期传代而增加的微生物污染的机会,细胞冻存已成为细胞培养常规的必备技术。冻存是指以一定冷冻速度将细胞悬液的温度降至-70℃以下,并在-196℃液氮中长期保存。目前,多数实验室在-196℃液氮罐中保存细胞,具备条件的实验室也可利用自动化冻存装置,以便于大规模冻存细胞。在-70℃以下条件下细胞内的生化反应极其缓慢,甚至停止。因此,冻存有利于维持细胞特性、减少微生物污染机会、储存暂不使用或转给他人的细胞。【材料】待冻存细胞处于指数生长期的单层贴壁细胞或悬浮细胞。冻存管容量为1.5ml、2ml或5ml。消化液0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合消化液。培养液DMEM。冻存液用7份培养液,2份FBS和1份DMSO或甘油配成,也可用含有20%DMSO的完全培养液。为避免操作过程中微生物污染,可在冻存液中适当添加抗生素。将冻存液放在4℃下预冷。仪器设备-70~-85℃超低温冰箱或程控降温仪、液氮罐。【操作程序】1.选择指数生长期的细胞,在冻存细胞前约24h换液1次。2.对于贴壁细胞,吸去培养液,加入消化液。收集消化后的细胞悬液,离心(1000r/min,5min）。对于悬浮生长的细胞，直接离心。3.弃去上清液,用冻存液混悬沉淀细胞,将细胞调整至105-107个/ml。4.将细胞悬液按合适的量(常为1-1.5ml)分装入冻存管内,拧紧管盖。在冻存管上标明细胞名称、代数、培养液名称、冻存日期和使用者姓名。5.将冻存管在4℃条件下放置30min,随后在-20℃冰箱内放置30-60min6.将冻存管移入-80℃超低温冰箱内过夜。有条件者可将冻存管放入程控降温仪内，以1℃/min的速度冷冻。7.取出冻存管,迅速转移入液氮罐内,长期冻存。【结果分析】1.细胞存活率可达90%以上。在-80℃超低温冰箱中细胞可保存数月,在-196℃中可保存数年。为了维持细胞活性,最好在冻存后1年复苏一次,然后再重新冻存。2.冻存效果取决于冻存液、冷冻速度和冷冻温度。细胞不同,冻存效果也不同。【注意事项】1.冻存前确认细胞未被污染,分析细胞系的可靠性。2.选择合适的冷冻速度和冷冻温度,以免在冻存过程中损伤细胞。3.常温条件下DMSO对细胞有毒副作用,故应将冻存液在4℃条件下放置40-60min后使用。另外,配制冻存液时要带手套。4.将冻存管放入液氮罐时,小心液氮溅出。操作时应穿戴防冻手套、防冻鞋、面罩和工作衣二.细胞的复苏复苏是指按一定复温速度将细胞悬液恢复到常温。当恢复到常温状态时,细胞的形态结构保持正常,生化反应即可恢复。【材料】1.70%乙醇。2.培养皿或培养瓶3.添加20%FBS的培养液。4.0.4%台盼蓝。5.恒温水浴箱或带盖的搪瓷杯【操作程序】1.从液氮罐中取出冻存管,立即放入37-40℃恒温水浴箱或搪瓷杯内,注意水位不能超过冻存管盖,以免增加污染机会。盖上箱盖成杯盖,将冻存管快速晃动,使冻存液快速融化,必须在1-2min内完成。2.取出冻存管,用70%乙醇彻底擦拭消毒,然后在超净工作台上打开管盖。3.将细胞悬液移入离心管,缓慢加入预温的培养液,离心(500-1000r/min,5min)。也可将细胞悬液直接接种入培养瓶,用培养液缓慢稀释后培养4-6h,然后更换新的培养液。4.弃去上清液,用培养液混悬沉淀细胞,调整细胞密度,将细胞接种于培养皿或培养瓶,放入培养箱中培养。5.记录复苏日期,次日更换新的培养液。【结果分析】1.形态学观察在相差显微镜下观察细胞复苏后的形态变化,以此可估计细胞的活性。2.细胞存活率将冻存管内剩余的细胞,用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞,活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞,得出细胞存活率3.复苏效果复苏效果主要取决于复温速度。【注意事项】1.应在1~2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢,则会造成细胞损伤。另外,细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行,以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。2.将培养液加入细胞悬液时,速度要缓慢,约以5ml/min的速度加入为宜,而且开始时要慢,随后可稍加快,以使冷冻保护剂从细胞内缓慢渗出到细胞外,避免高渗透压的损伤3.从液氮罐中取出冻存管时,应戴手套和护目镜4.如果冻存管密封不严,液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升,将可能发生爆炸。复苏过程中应盖上恒温水浴箱的盖。