水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程（征求意见稿）.docVIP

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安徽省市场监督管理局发布2023-××-××-实施2023-××-××-发布

安徽省市场监督管理局发布

2023-××-××-实施

2023-××-××-发布

水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程

TechnicalregulationfordoublePCRdetectionmethodofwaterfowlTembusuvirusandAstrovirus

（征求意见稿）

DB34/T××××—××××

DB34

安徽省地方标准

ICS65.020.20

CCSB31

DB34/T××××——2022

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件安徽农业大学提出。

本文件由安徽省农业农村厅归口。

本文件起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、滁州市动物疫病预防与控制中心、定远县畜牧兽医局、合肥华盟生物技术公司。

本文件起草人:王桂军、朱良强、许青华、李文来、郑举、范亚楠、何长生、汪秀娟、王扬龙、解新迪、张云凯、段倩倩、伍唯、沈思志、卢庆辉、俞兵、石玉花

水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测技术规程

1适用范围

本文件规定了水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测方法的主要仪器和设备、试剂、操作步骤、结果判定、实验室生物安全管理。

本文件适用于水禽坦布苏病毒和星状病毒双重PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1坦布苏病毒病

坦布苏病毒病，一种引起蛋鸭产蛋骤降、肉鸭或育成鸭出现神经症状为主要特征的急性传染病。

3.2星状病毒病

星状病毒病，一种以内脏和关节痛风为主要症状的传染性疾病，可引起雏鹅腹泻性肠炎、肾炎及尿酸盐沉积等症状，是引发雏鹅通风的重要原因之一。

4主要仪器和设备

4.1PCR扩增仪。

4.2台式低温高速离心机。

4.3电泳仪。

4.4凝胶成像系统。

4.5冰箱（-20℃：-80℃）。

4.6微波炉。

4.7分析天平。

4.8水浴锅。

4.9微量移液器（2.5μL；10μL；20μL；200μL；1000μL)。

4.10生物安全柜

5试剂

5.1RNA抽提试剂：Trizol或其他商品化RNA提取试剂。

5.2氯仿、异丙醇、无水乙醇：均为分析纯。

5.3商品化的反转录试剂盒

5.4溴化乙啶（EB）：配置方法见附录A。

5.51×TAE电泳缓冲液：配置方法见附录A。

5.6DNA分子标准（2000DNAMaker）

5.71%琼脂糖凝胶：配置方法见附录A。

5.8灭菌超纯水：符合GB/T6682，121℃、20min，高压蒸汽灭菌。

5.8引物

5.8.1扩增星状病毒（GAsTV）的引物，扩增DNA片段大小为300bp。

─上游引物：5-AGAAGGTGCGGAAGAGTGGTATGA-3

─下游引物：5-GCGAAGAGTGCGTAAGGAGGTTGT-3

5.8.2扩增坦布苏病毒（DTMUV）的引物，扩增DNA片段大小为404bp。

─上游引物：5-CTGATGGCTTTGGTCCTGTTC-3

─下游引物：5-ACACCTATTCTCACCACATCTAAC-3

5.9阴性对照品：灭菌超纯水。

5.10阳性对照品：坦布苏病毒cDNA和星状病毒cDNA。

6操作步骤

6.1样品的采集与处理

6.1.1样品采集

用无菌镊子和剪刀采集疑似坦布苏病毒和星状病毒感染或病死禽类各种组织与器官（肝脏、脾脏、肾脏等），装入EP管，编号备用。

6.1.2样品处理

取待检组织样品适量（0.1g)，按1:5倍（W/W)加入无菌0.1MPH7.4PBS，于灭菌并烘干的研钵或组织匀浆器中充分研磨，反复冻融3次后，4℃8000r/min离心20min，取上清1mL转至无菌的1.5mL离心管中液，编号备用。

6.2RNA提取

6.2.1用Trizol或其他商品化RNA提取试剂提取待测样品。

6.2.2200uL样品和1mLTrizol加入EP管中，4℃裂解10-20min,轻轻颠倒混