SDSPAGE电泳试剂配制.docxVIP

SDS电泳试剂

30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100mL,棕色瓶存于4OC；

1.5MTris-HCl(pH8.8)：Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；

1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100mL；

4?分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5MTris-HCl(pH8.8)，定容至100mL；

4?浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1MTris-HCl(pH6.8)，定容至100mL；

10?电泳缓冲液(pH8.3)：Tris3.029g，甘氨酸14.415g，SDS1g加ddH2O溶解,定容至100mL；

10%过硫酸铵（Aps,现配）：1gAP加ddH2O至10mL；

2?SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5mL，?-巯基乙醇1.0mL，SDS0.6g，甘油2.0mL，0.1%溴酚兰1.0mL，ddH2O3.5mL；

考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225mL，冰醋酸50mL，ddH2O225mL；

脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；

分离胶(12.5%): ddH2O4mL，30%储备胶5mL，4?分离胶缓冲液3mL,10%Aps0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；

12) 浓缩胶（5％）：ddH2O2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL，

10%Aps50μL，TEMED5μL。

Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）-SDS-PAGE蛋白质电泳1Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳溶液准备

正极缓冲液(10×)：14gTris溶于400mL重蒸水,用1.0MHCl调至pH8.9,定容至

500mL。

负极缓冲液(10×)：将60.55gTris,89.58gTricine及5gSDS溶于400ml重蒸水中,加水至终体积为500mL。

凝胶缓冲液(3×)：将181.5gTris,1.5gSDS溶于400mL重蒸水中,用1MHCl滴定至pH8.45,再加水稀释至500mL。

2丙烯酰胺储存液配制

1）3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)

将48g丙烯酰胺和1.5g甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL49.5%的储存液。2）5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)

用重蒸水溶解47g丙烯酰胺和2.5g甲叉双丙烯酰胺成100mL49.5%的储存液。3Tricine-SDS-PAGE的凝胶制作

小孔胶3mL:1mL凝胶缓冲液(3x)、0.4g甘油、1mL“6C凝胶储存液”、用去离子水稀释至3mL,临用时加入10ｕL的10%过硫酸氨溶液和1ｕL的TEMED。

夹层胶3mL:1mL凝胶缓冲液(3x)、0.61mL“3C凝胶储存液”,用去离子水稀释至3mL,临用时加入10ｕL的10%过硫酸氨溶液和1ｕL的TEMED。

浓缩胶2mL:0.5mL凝胶缓冲液(3x)、0.16mL“3C凝胶储存液”,用去离子水稀释至

2mL,临用时加入10ｕL的10%过硫酸氨溶液和1ｕL的TEMED。

用垂直小电泳槽制胶电泳。先铺小孔胶,接着均匀注入夹层胶,凝胶聚合后再铺浓缩胶。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析1）准备：

电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安装好电泳装置。

2）12.5%分离胶灌制

取一洁净的20mL烧杯，分别加入：

ddH2O 4mL

30%储备胶 5mL

4?分离胶缓冲液 3mL

10%Aps(现配) 0.1mL

100%TEMED 0.01mL

轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。3）5％浓缩胶灌制

取一洁净的20mL烧杯，分别加入：

ddH2O 2.65mL

30%储备胶 0.85mL

4?浓缩胶缓冲液 1.25mL

10%Aps 50μL

100%TEMED 5μL

待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。