项目6-3赖氨酸的测定 -2 (1).pptVIP

《生物产品的分析与检验技术》项目六氨基酸的分析与检验任务三赖氨酸的测定主讲教师：左莹生物技术及应用专业教学资源库

■赖氨酸(L-Lysine)是人体必需氨基酸之一，学名为二氨基己酸，其化学组成为C6H14O2N2，相对分子质量为146.19。具有不对称的α碳原子，故有L型、D型两种异构体，DL型赖氨酸是等分子L型、D型的混合体，其中只有L-赖氨酸是才能被生物体所利用，所以通常所说的赖氨酸技术指L-赖氨酸，它也是世界上仅次于味精的第二大氨基酸品种。

L-赖氨酸的化学名称为L-2,6-二氨基己酸或α，ε一二氨基己酸，属于单斜晶系，熔点为263℃，难溶于醇和醚，易溶于水，等电点为9.59。游离的L-赖氨酸具有很强的呈盐性，极易吸收空气的CO2生成碳酸盐，故一般商品是以L-赖氨酸盐酸盐的形式存在。L-赖氨酸盐酸盐的化学组成为C6H15O2N2Cl或C6H14O2N2·HCl，其相对分子量为182.64，化学性质稳定，为无色晶体，几乎无味，易溶于水，难溶于醇和醚，在25℃的水中溶解度为793g/L。

■赖氨酸是一种碱性氨基酸，是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的生物价大大提高，因此赖氨酸的应用范围很广。据统计全世界赖氨酸产量的5%左右用于医药工业，约5%用于食品工业，其余的90%左右用于饲料工业。■赖氨酸的价格较高，产品品质参差不齐，甚至还有掺假现象，因此掌握正确的赖氨酸检测方法，不仅可为用户提供购选产品及计算配方用量的参考，同时也可作为识别假冒伪劣产品重要的手段和依据。■检测赖氨酸的方法主要有茚三酮溶液显色法、高效液相色谱法等。

任务三赖氨酸的测定一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量1.原理赖氨酸赖氨酸残基有自由的ε-NH2，它与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定赖氨酸的含量。

2.试剂与仪器■缓冲溶液：称取30g甲酸钠，溶解于约60mL蒸馏水中，加入10mL8％的甲酸，最后加水到100mL■茚三酮试剂：称取1lg茚三酮和1g氯化镉(CdCl2?H2O)，加入25mL上述缓冲溶液和75mL乙二醇，室温下放置一天，第二天使用。若出现沉淀，则过滤后使用。注意该溶液不能现用现配，一定要配制好后第二天使用，也不宜放置过久■4％和2％无水碳酸钠溶液：各50mL■标准亮氨酸溶液：准确称取25mg亮氨酸，加数滴稀盐酸，待溶解后定容至50mL，该溶液亮氨酸浓度为500μg／mL。准确吸取上述母液1、3、5、7、9mL，分别稀释至25mL，待用■722型分光光度计、水浴锅一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量

3.操作步骤（1）绘制标准曲线准确吸取已配好的标准浓度系列的亮氨酸溶液各0.5mL,分别放入5支试管中，每种浓度做3个重复。再取一支试管加入0.5mL蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加入0.5mL的4％碳酸钠溶液和2mL茚三酮试剂（头一天配好的），混匀，在80℃恒温水浴上保温30min。取出后，立即放入冷水浴中冷却3min，然后向每管内加入5mL的95％乙醇，摇匀，在分光光度计上500nm波长处进行比色，以空白做对照，读取吸光度。以吸光度值为纵坐标，亮氨酸浓度为横坐标，绘出标准曲线，并求出曲线的斜率。一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量

3.操作步骤（2）样品的测定准确称取样品25mg，放入试管中(试管应预先烘干)，加入约300mg细石英砂(估计数字)和1mL2％碳酸钠溶液，用圆头玻棒充分搅拌2min，注意切勿将试管挤破，将试管放入80℃恒温水浴中，提取10min，应常搅动。取出试管，向每管内按顺序加入2mL茚三酮试剂，混匀，放入80℃恒温水浴中，保温显色30min，同时以蒸馏水做一空白对照，取出后立即放入冷水浴中冷却3min，以下步骤与步骤做法相同。加完乙醇后进行过滤，用滤液进行比色，读取吸光度。若样品颜色过深，则可取一定量的滤液用95%乙醇稀释后比色，吸光度的数值以在标准曲线范围内为宜。在标准曲线上查出相当的亮氨酸含量。一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量

4.结果计算赖氨酸含量计算按下式进行：式中X——样品中赖氨酸含量，μg／mgc——为标准曲线上查出的亮氨酸的量，μg／（0.5mL）N——为样品稀释倍数m——为样品的质量，mg一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量

标液体积（/mL）溶液中氨基酸含量（μg/mL）吸光度A1.03.05.07.09.05.结果记录(1)标准曲线的绘制一、茚三酮显色法测定赖氨酸含量

5.结果记录(2)赖氨酸含量的测定测定内