第13章-酶类药物.pptVIP

盐浓度一般以等渗为好，相当于0.15mol／LNaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。2、有机溶剂法某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇。3、表面活性剂法表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。三、酶制剂的工业提取法（一）发酵液的预处理及过滤微生物发酵液的分离，过滤，发酵液中加絮凝剂或凝固剂。絮凝剂有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸。（二）酶液的脱色活性炭、脱色树脂。（三）盐析法用得最多的是（NH4）2SO4，在常温下不会造成酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少。（四）有机溶剂法有机溶剂沉淀蛋白质的能力为丙酮＞异丙醇＞乙醇＞甲醇。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂喷雾干燥用于干燥菌体，药用酶常用冷冻干燥。四、酶的纯化评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活，二是总活力回收。酶在纯化过程中的一些技术难点：（一）杂质的除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等。（1）pH和加热沉淀法（2）蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。（3）选择性变性法利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。可用2.5%三氯乙酸处理。（4）核酸沉淀剂法用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于离心分离。用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。（5）将酶与底物结合酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，热稳定性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。（二）脱盐和浓缩1、脱盐脱盐方法是透析和凝胶过滤。2、浓缩酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。（三）酶的结晶把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50%以上），可使其结晶，酶的纯度经常有一定程度的提高。为研究蛋白质空间结构提供X射线衍射样品。1、酶的结晶方法酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。（1）盐析法操作要在低温下进行，加盐，缓冲液pH要接近酶的等电点。多数酶就可形成结晶。有时也可交替置在4℃冰箱中和室温下来形成结晶。（2）有机溶剂法酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。一般要含少量无机盐的情况下，选择使酶稳定的pH，缓慢地滴加有机溶剂。使用的缓冲液一般不用磷酸盐，而用氯化物或乙酸盐。（3）复合结晶法有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或盐的性质来结晶。（4）透析平衡法（5）等电点法2、结晶条件的选择（1）酶的纯度酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的单晶可能性也越大。结晶对酶有明显的纯化作用。（2）酶的浓度（3）温度结晶的温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变性。（4）时间结晶形成的时间,数小时到几个月，有的甚至需要1年或更长时间。一般来说，较大而性能好的结晶是在生长慢的情况下得到的。一般希望使微晶的形成快些，然后慢慢地改变沉淀条件，再使微晶慢慢长大。（5）pH调整pH可使结晶长到最佳大小，也可改变晶形。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的等电点附近。（6）金属离子许多金属离子能引起或有助于酶的结晶，在酶的结晶过程中常用金属离子有Ca2+、Zn2＋、Co2＋、Cu2＋、Mg2＋、Mn2＋、Ni2＋等。（7）晶种不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微量的晶种才能结晶，（8）结晶器皿处理结晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用结晶母液再冲洗一次。结晶的玻璃器皿，可用硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿。这样可减少晶核数目，形成大的结晶。（四）酶分离和纯化工作的注意事项1、防止酶蛋白变性2、防止辅因子的流失3、防止酶被蛋白水解酶降解（一）胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）胃蛋白酶广泛存在于哺乳类动物的胃液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。1、组成（结构）、性质药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。水溶液呈酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。pI为pH1.0，最适pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和pH4的20％乙醇中。