苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定.pdfVIP

苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定

一、目的

掌握纯化酶的基本操作和方法；学习一种常用的酶活力测定法。

二、原理

苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonialyase,简称PAL；EC4.3.

1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、

异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌

侵害过程中起重要作用。PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨，反式

肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在

几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。规定1h

内A290增加0.Ol为PAL的一个活力单位。

三、试剂和材料

(1)0.lmol硼酸一硼砂缓冲液(pH8.7)

(2)酶提取液0.1mol/I硼酸一硼砂缓冲液（含1mmol/I,EDTA,20mmol/

Lβ一巯基乙醇）

（3）0.6m.ol/I-L一苯丙氨酸溶液

（4）6mol/lHCl

(5）固体硫酸铵

(6）0.02mol/l-磷酸盐缓冲液（pH8.0,含0.5mmol/LEDTA,2.5%甘

油，20nlmol/l.β-巯基乙醇）

（7）SephadexG一25

（8）DEAE纤维素52

（9）标准蛋白质溶液（100ug/ml）：准确称取IOmg牛血清自蛋自于烧

杯内，用蒸馏水溶解，完全转移到100ml容量瓶内，定容至刻度，混匀。

（10）考马斯亮蓝G-250蛋白质染色液：称取10mg考马斯亮蓝G-250,溶

于5ml95`%乙醇中，加入85％（W/V）磷酸loml，混匀后即为母液。用

时，按15ml母液加85m1蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。

（11）滴管

(l2)止水夹

材料：供试植物材料

四、操作步骤

（1）酶液提取植物材料lg，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰

浴上研钵研磨。

(2)将已匀浆的酶液用三层纱布过滤。滤液转入离心管，10000g冷冻离心30

分钟。

(3)取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，放置冰浴中备用。

（4）硫酸铵分级沉淀酶蛋白

从酶粗提液中吸出0.5m1，以作后面活力测定用。余下酶液根据实际体积、温

度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶液中的硫酸铵量，并

称硫酸铵。

将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，

再缓慢搅拌10min;然后于10000g下冷冻离心l0min,保留上清液于烧杯

内。

根据硫酸安饱和度用量表，算出从38％到75％饱和度所需硫酸铵用量。按上

述同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。将沉淀溶于1ml酶抽提液中。

（5）SephadexG一25层析脱盐

凝胶溶胀：称取SephadexG一255g,加入适量0.02mol/I.磷酸盐缓冲

液，在室温下溶胀。待溶胀平衡后，虹吸去除上清液中的细小凝胶颗粒，这样处

理2一3次。

装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，将20m1蒸馏水装入柱内，打开止水夹赶去

出口内气泡，当柱内保留1ml左右水层时，把处理好的SephadexG25用玻

璃棒搅匀，尽量一次加入柱内，待胶床表面仅有1-2cm液层时，旋紧止水夹、。

装好的胶柱应无气泡、无节痕、床面平正，床面铺1张圆形滤纸片。

上样：让胶床表面几乎不留液层，将lml酶液小心注入胶床而中央，注意不要

冲坏床面，吸取lm！磷酸盐缓冲液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱内，在

床表面仅有lml左右液层时，再小心地用滴管加入5-6cm高的磷酸缓冲液

洗脱。

洗脱收集：取刻度试管5支（包括上面一支），编号，柱床上面不断加磷酸盐

缓冲液洗脱，出水口不断用刻度试管收集洗脱液，每管收集3m1。

测定每管的PAL酶活力，合并PAL活力高的试管，记为酶洗脱液。

（6）DEAL纤维素柱梯度洗脱

称取DEAE纤维素52