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(一)、配置不连续的凝胶(5%浓缩胶,11%的分离胶,采用化学聚合法)试剂:
1、Arc-Bis(30%):29.2gArc+0.8gBis加水稀释至100ml,4℃下棕色瓶保存。
2、10%的过硫酸铵:1克加水至10ml,棕色瓶保存一周。
3、TEMED原液
4、分离胶缓冲液(1.5MTris-HCl,pH=8.8):
27.23gTris溶于80ml水中,用6NHCl调pH至8.8,定容至150ml。
5、浓缩胶缓冲液(0.5MTris-HCl,pH=6.8):
6gTris溶于60ml水中,用6NHCl调pH至6.8,定容至100ml。
6、电极缓冲液(0.025MTris,0.192M甘氨酸,pH=8.3):
3.03gTris,14.4g甘氨酸,加水定容至1000。
7、样品缓冲液
5.8ml水+1ml pH6.8,0.5MTris-HCl+0.8ml的甘油(或2克蔗糖)+0.4ml 0.5%
的溴芬兰
8、染色液CBB-R250:甲醇500ml,乙酸100ml,CBB-R2501g,蒸馏水400ml
9、脱色液:乙酸70ml,甲醇50ml,蒸馏水880ml
(二)、电泳
(三)、染色与脱色
注:不同浓度聚丙烯胺凝胶的配置 10ml
T%
蒸馏水
凝胶缓
30%Arc-Bis
10%过硫
TEMED
ml
冲液
ml
贮液ml
酸铵ul
ul
*4%
6.15
2.5
1.33
70
10
*5%
5.8
2.5
1.67
70
10
6%
5.45
2.5
2.00
70
10
7%
5.15
2.5
2.33
70
5
8%
4.8
2.5
2.67
70
5
9%
4.45
2.5
3.0
70
5
10%
4.15
2.5
3.33
70
5
11%
3.8
2.5
3.67
70
5
12%
3.45
2.5
4.0
70
5
13%
3.15
2.5
4.33
70
5
14%
2.8
2.5
4.67
70
5
15%
2.45
2.5
5.0
70
5
16%
2.15
2.5
5.33
70
5
17%
1.8
2.5
5.67
70
5
4%-5%的凝胶是浓缩胶,用浓缩胶缓冲液,
6%-20%的凝胶是分离胶,用分离胶缓冲液。
六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纤溶酶的分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%浓缩胶,12-15%的分离胶,采用化学聚合法)试剂:
1、Arc-Bis(30%):29.2gArc+0.8gBis加水稀释至100ml,4℃下棕色瓶保存。
2、10%的过硫酸铵:1克加水至10ml,棕色瓶保存一周。
3、TEMED原液
4、分离胶缓冲液(1.5MTris-HCl,pH=8.8):
27.23gTris溶于80ml水中,用6NHCl调pH至8.8,定容至150ml。
5、浓缩胶缓冲液(0.5MTris-HCl,pH=6.8):
6gTris溶于60ml水中,用6NHCl调pH至6.8,定容至100ml。
6、电极缓冲液3.03gTris,14.4g甘氨酸,1gSDS,加水定容至1000ml。
(0.025MTris,0.192M甘氨酸,pH=8.3)7、样品缓冲液
0.8ml浓缩胶缓冲液+2ml 10%SDS+0.6ml巯基乙醇+2克蔗糖+0.05g溴芬兰,加
水至10ml。
8、染色液CBB-R250:甲醇500ml,乙酸100ml,CBB-R2501g,蒸馏水400ml
9、脱色液:乙酸70ml,甲醇50ml,蒸馏水880ml
SDS注:不同浓度聚丙烯胺凝胶的配置 10ml
SDS
T%
蒸馏水
凝胶缓
30%Arc-Bis
10%过硫
TEMED 10%
ml
冲液
ml
贮液ml
酸铵ul
ul ul
*4%
6.15
2.5
1.33
70
10
100
*5%
5.8
2.5
1.67
70
10
100
6%
5.45
2.5
2.00
70
10
100
7%
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2.5
2.33
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5
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8%
4.8
2.5
2.67
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9%
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2.5
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4.0
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5
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2.8
2.5
4.67
70
5
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15%
2.45
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