11-第05章-3-基因组编辑1.pptx

第5章基因组序列诠释---实验验证--基因组编辑基因组编辑(genomeediting)是一种人工靶向诱导基因组目标DNA序列发生突变的遗传工程。通过导入的核酸酶使DNA靶点发生双链DNA断裂，再经细胞内DNA修复系统在靶点引入突变。这一技术涉及两个问题：1）如何实现靶向？2）怎样产生双链DNA断裂（DSB）？

基因组编辑技术基因组编辑技术有4种：1) meganuclease(罕见位点核酸酶)2）ZFNTALENCRISPR/Cas9orCRISPRi

Meganulease-罕见位点核酸酶I-Sce是酵母线粒体基因组中一个内含子编码的限制性内切酶，识别18bp序列。内含子两侧含有I-Sce位点，当I-Sce基因表达产生I-sce酶时：1）可将I-Sce内含子切离，产生无内含子位点；2）寻找同源的宿主内无内含子的等位位点，将其切开。然后通过同源重组产生含有内含子的等位I-Sce位点。这一遗传现象称之为内含子归巢(homing)。利用I-Sce专一性酶切并随之发生双链断裂修复特点，可用来进行基因组编辑。由于I-Sce位点在绝大所数物种基因组中极少存在，因而实际应用价值不大。MolecularCell10895-905，2002

ZFN—锌指核酸酶什麽是ZFN:ZFN,Zinc-FingerNucleases(锌指核酸酶)的简称。ZFN技术原理： PNAS93：1156-1160，1996转录因子锌指结合蛋白的DNA结合域可专一性与基因调控元件（element）结合，每个锌指基序可以专一性识别并结合3个连续排列的碱基（-NNN-）。结合DNA的锌指多肽与核酸内切酶Fok1连接组成融合蛋白，称之锌指核酸酶。锌指核酸酶可在体外或体内定点切割DNA双链。如果切割位置在基因编码区，即可定点打靶基因。

锌指基序及锌指蛋白锌指蛋白是真核生物中最丰富的转录因子之一。图示TFIIIA是5SrRNA基因的转录调控因子,含9个锌指基序,可识别与结合启动子区33个碱基序列，控制基因表达。Zif268(小鼠蛋白)是最早用于基因打靶的锌指蛋白转录因子,含3个锌指基序，识别9bp序列，与限制酶Fok1组成融合蛋白用于基因组编辑。

ZFN的工作原理将锌指蛋白（Zif268）与内切核酸酶（Fok1）组成融合蛋白Zif-FN(ZFN)。当ZFN的锌指结构域识别并结合特定DNA序列时，连接的Fok1内切核酸酶可非特异切割邻近DNA，造成DNA断裂，由此启动DNA修复系统进行同源重组修复或非同源重组修复。这两种修复均会造成修复DNA位点碱基缺失或插入，从而引起突变。NatureReviewGenetics11:636-646,2010

基于Zif268锌指基序的3碱基识别模块每个锌指基序可结合3个碱基。当基序中的氨基酸残基发生代换时，可改变基序结合的碱基顺序。据此可以进行锌指氨基酸代换实验，并对识别碱基序列检测。由此可建立锌指基序库，组成识别模块群。这些识别模块可排列组合，用于基因打靶序列的选择参考。

基因组编辑技术-TALEN什麽是TALEN:TALEN是Transcriptionactivator-likeeffectornucleases(转录激活因子样效应物核酸酶)的简称，与ZFN的技术原理有相似之处。TALEN系统中，效应子DNA结合域（TAL）取代了ZFN中的锌指蛋白，与之连接的内切核酸酶仍然是Fok1。

TAL碱基结合模块与模块组合TAL效应子由33-34aa高度保守的重复多肽组成。重复多肽之间仅在第12和13位置有两个aa差异，与专一性识别碱基序列有关。识别A,T,C和G的多肽单元分别人工合成组成模块，根据识别的DNA序列组建工程多肽链。Science 326：1501,2009

基因组编辑技术--Cas9发现CRISPR系统CRISPR系统的结构Cas9工作原理及应用

发现CRISPR嗜热乳酸链球菌(Streptococcusthermophilus)酸奶发酵菌。抗噬菌体侵染的乳酸链球菌基因组中含有一种特别的遗传成分—CRISPR(规律性簇集间隔分布短回文重复序列)，具有DNA免疫的功能。Science315：1709-1712，2007

CRISPR系统重复/间隔顺序1，重复序列长约26-37nt,5’和3’末端有部分回文对称序列;2，间隔序列（数字编号）与重复顺序大小相似,35-44nt,不同间隔序列之间不重复;3，间隔序列是细菌获取的外源侵染DNA序列（pro-spacer，原间隔顺序），用于DNA免疫反应。

化脓性