B淋巴细胞荧光标记实验.pptx

B淋巴细胞荧光标记实验组员王科何远芬刘鑫鹏申春生余秀娟罗亚萍杨再先

实验目的1.掌握免疫荧光标记技术直接法的原理和操作方法;2.熟悉荧光显微镜的使用方法。

实验原理B淋巴细胞表面携带mIg，为B细胞特异性的表面标志，能与相应的特异性抗体结合，故可用荧光标记的抗Ig血清进行免疫荧光染色镜检。由于B细胞在分化过程中的每个阶段均具有mIg的标志，故该法可检测出全部B淋巴细胞。每一个B淋巴细胞表面可携带不同类Ig，即IgM,IgD,IgG,IgA或IgE，如分别用荧光标记的抗Ig单克隆抗体染色，则可鉴别带不同类Ig的B淋巴细胞。能与荧光标记抗体结合的细胞，在荧光显微镜下细胞膜呈现荧光，即mIg阳性细胞，也就是B淋巴细胞。同时用普通光源照明，计数该视野的淋巴细胞总数，根据发荧光和不发荧光的细胞计数，可算出B细胞的百分数。

材料1.FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗人IgM。2.受检者静脉抗凝血。3.RPMI1640完全培养液。4.5%胎牛血清Hank’s液。5.淋巴细胞分离液（比重1.077±0.001）6.0.2%台盼蓝染液。7.清洁载玻片、盖玻片、血球计数板、计数器、毛细吸管、试管、显微镜/荧光显微镜。

操作方法1.淋巴细胞分离；2.用RPMI1640完全培养液重悬分离分离得到的单个核细胞，混匀后计数，用0.2%台盼蓝染色测细胞活力，活细胞数应大于95%。用RPMI1640完全培养液将细胞悬液配成5×10^6／ml。3.在试管中加入配好的的淋巴细胞悬液0.1ml,再加入荧光抗体0.1ml，放置4℃作用30min。4.加已经37℃预温的含5%胎牛血清Hank’s液2～3ml,1500rpm离心10min，去上清液，如此重复洗涤2次。5.取沉淀细胞滴加在载玻片上，覆以盖玻片，置荧光显微镜下观察

实验结果的观察与分析免疫荧光染色细胞的形态和类型：凡呈现微弱，均匀一致的暗淡荧光者为非B细胞；凡细胞呈现较强荧光，有明显的细胞轮廓，并可见环状或两个以上斑点或在细胞的一侧见有帽状结构的为mIg阳性细胞---B细胞。一般先用荧光显微镜紫外光计数荧光阳性细胞数，继用普通光源计数同一视野中淋巴细胞总数。每份标本计数200个淋巴细胞，着荧光者为B淋巴细胞，计算其百分率，同时按原血标本中淋巴细胞的总数计算B淋巴细胞的绝对值。

注意事项每次试验前荧光抗体需3000rpm离心30min,去除血清中的聚合蛋白。荧光抗体与细胞孵育是应在4℃或冰上，避免非特异性结合。细胞形态的观察具有一定的主观性，需仔细判断。