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前言

牛结节疹检疫技术规范

SN/T2515—2010

8.3.1.2用培养液稀释病毒至100TCIDo/50gL。加入50μL工作病毒抗原置滴定试验孔中。每一

块96孔培养板可检验32份血清。

8.3.1.3将培养板置5%的二氧化碳培养箱37℃感作1h。

8.3.1.4辑孔加已培养好的3×10°ml.细胞悬液100μl.。

8.3.1.5置37℃二氧化碳培养箱进行培养9d,连续观察CPE。

8.3.1.6同时做病毒回归试验以测定病毒实际TCIDko,

8.3.2对照

8.3.2.1阳性血清和阴性血清均按被检血清进行。

8.3.2.2病毒回归试验，即重新测定病毒的TCIDn。将病毒抗原做10倍系列稀释至10-*,每个稀样度加4孔，每孔加50pL,补加50pL.培养液，再加入细胞悬液100pL,计算试验所用50pL.病毒液含有实际的TCIDo。

8.3.3结果判定

8.3.3.1用倒置显微镜从第4大起每天观察细胞CPE变化，当病毒抗原对照、阴性血清对照均出现CPE.阳性血清对照无CPE,待检血清对细胞无毒性，对照细胞生长正常，抗原实际用量在50TCID/

50gL~150TCID/50pL.范围内方能判定结果，第9天终判，抗体效价滴定判读标准是以待检血清最高稀释度50%保护为该待检血清的中和效价，以能保护细胞免于破坏的血清最高稀释度为该血清滴度。

8.3.3.2中和滴度大于等于115为阳性，小于115为阴性。

8.3.3.3每次试验中，阳性对照血清滴度不应比其已知效价差1个滴度以上，回归滴度变化应在

50TCID?o~150TCID之间。

8.3.4结果解释

通常血清中和试验是最特异的血清学试验方法，但LSD感染后主要是细胞免疫，阴性结果免疫应答较温和，并非意味着动物没有产生抗体，而动物感染LSD病毒仅产生低水平的中和抗体，因而不够敏感。因此在采用中和试验结果的同时，结合临床症状(参见附录B)等方法做最终判定。

SN/T2515—2010

附录A

(规范性附录)

试剂配制

A.1肝素

125IU/mL.血液终浓度封管。

A.2EDTA

EDTA用量为1.5mg/mL~2.5mg/ml.血液终浓度。

EDTA母液需分装，高压灭菌，4℃保存。

A.310%甘油运输液

Hanks平衡盐10倍浓缩液

氯化钠(NaCl)80

氯化钾(KCl)4.0g

硫酸镁(MgSO?·7H:O)1.0g

氯化镁(MgClg·6H?O)1.0g

氯化钙(CnCl?)1.4g

葡萄糖10g

双燕水800mL.

配制方法：依照上列顺序称取各试剂，并依次溶解于双蒸水中，定容至1000ml,分装，高压灭菌，贮存于室温或4℃。

使用前，取Hank’s平衡盐10倍浓缩液，用灭菌双蒸水稀释至工作液，并含复合抗生素及10%甘油，即为10%甘油运输液。

A.4pl7.0磷酸盐缓冲液(PBS)的配制

A液

氯化钠(NaCl)

6.0R

氯化钾(KCl)

0.2R

氯化钙(CnCl?·2H?O)

0.132g

氯化镁(MgCl?·2H?O)

0.1g

双蒸水

100ml.

B液

磷酸氢二钠(Na?HPO?)

1.15g

磷酸二氢钾(KH?PO?)

0.2g

双燕水

200ml.

依次称取各试剂并依次溶解在双燕水中。

以0.104MPa~0.112MPa15min高压灭菌A液和B液。

冷却后，将B液缓慢倒入A液中搅拌均匀。

分装于500mL~1000ml.灭菌瓶中。

取1mL~5mL.接于NB(营养肉汤)中进行无菌检验。

SN/T2515—2010

贮存于4℃或室温。

A.5复合抗生素

青霉素销盐，每毫升含1000国际单位(IU/ml.),硫酸链霉素1mg/mL,制霉菌素100IU/ml.,或

两性霉素2.5μg/mL,和新霉素200lU/mL。

A.6苏木精-伊红染色

苏木精

氧化汞

乙醇

硫酸铝钾(或硫酸铝铵)

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