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SN/T2080—2008

栎树猝死病菌检疫鉴定方法

1范围

本标准规定了植物检疫中标树猝死病菌的检疫鉴定方法。

本标准适用于针对栎树猝死病菌寄主的苗木、原木、树皮、枝条、枝叶等植物部分及其土壤和介质，以及木材、木包装和木制品的入境检疫。

2原理

2.1分类地位

英文名：pathogenofsuddenoakdeath,pathogenoframorumleafblight

学名：PhytopthoraramarumWerres,DeCoek.ManintVeld

栎树猝死病菌(Phytophthorsramorum).也称多枝疫霉，属真菌界(Fungi),卵菌门(Oomycota)卵菌焖(Oomycetes),腐霉目(Pythiales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉属(PhytophthoradeBary)。

Phytophthoraramarrs可侵染多种林木和花卉植物，造成杯树等树木算死(SuddenOakDeath.简称SOD),以及杜鹃、英莲等花卉枝叶粘萎(TwigBlightofRhododendron)。

病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录A和附录B。

2.2鉴定原理

根据标树猝死病菌在寄主上的为害症状，形态学特性、巢式PCR特异性扩增片段作为鉴定依据。

3仪器和用具

3.1仪器

3.1.1生物显微镜，体视显微镜。

3.1.2光照生物培养箱。

3.1.3高压灭菌器。

3.1.4高速离心机。

3.1.5PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。

3.2用具

3.2.1塑料盒。

3.2.2黑光灯(18W,320mm～380nm)。

3.2.3塑料研杵，移液器。

4试剂和培养基

4.1试剂

4.1.1琼脂粉，V8液·胡萝卜，杜鹃叶片。

4.1.250%匹马霉素，氨苄青霉素钠盐，利福平钠盐，五氟硝基苯，碳酸钙。

4.1.3SDS,Tris-HCl,氯化镁，盐酸，EDTA,氢氧化钠，乙酸钠，氯化钾，Tris.CTAB,TBE,无水乙醇，

苯酚，溴化乙锭(EB),三氯甲烷，异丙醇，异戊醇。

4.1.4蛋白酶K,Tag聚合酶·dNTP.DNA分子量Marker(100bp)。

4.1.5巢式PCR引物Phytol/Phyto4,Phyto2/Phyto3。

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SN/T2080—2008

4.2培养基

4.2.1选择性培养基PARP-V8

50ml.过滤后的V8液，17g琼脂，950ml.燕馏水，灭菌后冷却到50℃,加入在50%的西马霉素0.01g、氨苄青霉素钠盐0.25g.利福平钠盐0.01g和五氧硝基苯0.05g《可按比例在二甲基亚砜中溶解后加入)。

4.2.2胡萝卜丝培养基CPA

50g胡萝卜切丝，22g琼脂，1000ml.燕馏水，灭菌。

4.2.3V8培养基

V8液体100mL,加入2.5g碳酸钙，15g琼脂，蒸馏水900mL,灭菌。

5鉴定方法

5.1症状检查

检验苗木时，主要查验枝梢和叶部。杜鹃花等花卉植物症状为叶片上有黑褐色病斑，茎部有凹陷溃疡斑，枝梢和叶常出现枯萎。检验标树等原木木材时，重点查验溃疡斑。流疡凹陷或平坦，常有暗红至黑色的粘性流胶渗出，树皮内部组织褪色，坏死区域的边缘有照环围绕。取有疑似症状的植物的叶、枝、树皮、根等植物部分做分离培养。

土壤和栽培介质也是传播病菌的主要途径，检验时收集被携带进境的土壤和栽培介质，做诱集

试验。

5.2分离培养和诱集

5.2.1植物组织和木材的分离培养

取植物组织或木材上的病健交界处(无明显症状的取靠近地下部的组织)5mm～10mm,0.5%次氯酸钠消毒2min~5min.在选择性培养基PARPV8和胡萝卜丝培养基CPA上，20℃~22℃黑暗培

养1周~2周。如有白色真菌菌落出现，可转入V8培养基上20℃12h光照/12h黑暗培养。

5.2.2土壤和裁培介质的诱集

塑料盒中放入土壤或介质，加入2倍体积的无菌双蒸水，将数张健康的杜鹃叶片(国内市场上杜鹏品种即可)流水冲洗干净，滤纸吸干水分，叶面朝上漂放在水上，盖上盒盖，15℃12h光照/12h黑暗培养。3d后开始检查，取有失绿或水浸状斑的叶片，切取病健交界处，在胡萝卜丝培养