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SN/T1311—2003

马尔堡病检测方法

1范围

本标准规定了马尔堡病检测方法。

本标准适用于马尔堡病抗体水平的检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本标准。

2.1

ELISA酶联免疫吸附试验。

2.2

IF免疫荧光试验。

2.3

MBG马尔堡病。

2.4

PBS磷酸盐缓冲液。

2.5

TCID?半数细胞感染量。

2.6

CPE细胞病变效应。

2.7

OD值光密度值。

3原理

3.1IF试验

将感染MBG病毒的细胞固定在带面的载玻片上，在特异性抗体存在时，利用抗原抗体反应具有高度特异性这一特点，再加上荧光色素标记的二抗，与结合在抗原上的抗体结合，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

3.2ELISA试验

将抗原包被在酶标板上，在特异性抗体存在时，抗原抗体结合，再加入酶标二抗，形成抗原抗体酶标二抗复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，产生有色物质。根据有色物质的有无及其浓度，间接推测抗体是否存在以及其效价。

4试剂和材料

试剂和材料的准备如下：

—MBG病毒：由指定单位提供；

—包被用重组核蛋白抗原；由指定单位提供；

—阴，阳性血清；由指定单位提供；

——细胞抗原片；由指定单位提供或自制；

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——被检血清：用真空管采集血液，无菌分离血清，-20℃保存。用前60℃灭活1h;

—酶标二抗：由指定单位提供；

——底物溶液：由指定单位提供；

——荧光素标记二抗：由指定单位提供；

—细胞：Vero细胞；

——细胞背养液、维持液、细胞分散液、包被液、洗涤液、稻释液、终止液、PBS的配剖见附录A。

5器械和设备

器械和设备的准备如下：

——荧光显微镜；

——酶标仪；

——96孔酶标板；

——带圈载玻片；

——单道和多道可调微量移液器20pL～200pL;

—温箱；

——倒置显微镜；

——冰箱，

6操作方法

6.1IF试验

6.1.1细胞抗原片的制备

将Vero细胞培养成单层，用无菌PBS洗一遍，接种10*TCIDg/0.05mL～10TCIDa/0.05mL

量的MBG病毒，6d后，20%～40%感染细胞出现CPE,例掉液体，用细胞分散液漂洗一次，加入细胞分散液，37℃作用3min~5min,待细胞开始脱落前将分散液倒掉，(150mL细胞瓶)加入10mL.PBS(含5%犊牛血清，防止细胞成团),用吸管用力吹打。取5mL细胞悬液加到直径10cm的平皿内，紫外线照射20min灭活病毒，将细胞悬液稀释成1.2×10°个细胞/mL,在带圈载玻片上每孔加0.015mL,保证大多数细胞未感染，少部分细胞为带毒细胞。将载玻片空气干燥后，丙酮固定10min,放在塑料袋内，Co照射(200000rnds),以消除病毒的传染性，后保存于一70℃备用，

以上步骤必须在生物安全N级实验室内进行，

6.1.2正式试验

取出细胞抗原片，温至常温。将持检血清和阴，阳性血清用PBS作1:2、1:4、1:8等倍比稀释，加到细胞抗原片上，每个稻释度的血清加两孔，量以不溢出为宜，置湿盒内，37℃感作30min,取出用PBS冲洗三遍，加用PBS作(1:10)～(1:50)稀释的荧光素标记二抗(内含伊文斯兰1:1000),置湿盒内，37℃感作30min,取出用PBS冲洗三遍，空气干燥后，用pH9,0的碳酸缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。

6.2ELISA试验

6.2.1包被

按照提供的重组核蛋白抗原所附说明书要求，用包被液将抗原稻释，包被96孔板，每孔100pL,置

4℃冰箱过夜，

6.2.2血清稀释

将待检血清和阴，阳性血清用稀释液作11400至116400的倍比稀释。

6.2.3加样

取出96孔板，用洗涤液洗涤三次，每孔加100μL稀释血清，每个稀释度的血清加两孔，37℃感作

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1h。

6.2.4洗涤

倒掉血清，用洗涤液洗涤三次，每次5min。

6.2.5加酶标二抗

用稀释液将酶标二抗按说明书要求稀释，加到96孔板内，每孔100μL,37℃感作1h,6.2.6洗涤

倒掉酶标二抗，用洗涤液洗涤三次，每次5min。

6.2.7加底物

每孔加100pL底物溶液，酶标板置暗盒内15min。

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