鹿流行性出血病检疫技术规范.docxVIP

鹿流行性出血病检疫技术规范

SN/T1161-2010

6病毒分离及鉴定

6.1病毒分离

6.1.1试剂与材料

6.1.1.1鹿胎肾细胞或幼仓鼠肾细胞(BHK-21):使用时配制成3×10°个/mL细胞悬液。

6.1.1.2EHDV阳性血清和阴性血清：试验前血清需经56℃灭能30min。

6.1.1.310日～11日龄SPF鸡胚。

6.1.1.4细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS、BLP等，配方及配制方法见附录B。

6.1.2设备

6.1.2.1倒置光学显微镜，荧光显微镜。

6.1.2.2二氧化碳培养箱。

6.1.2.3研钵或组织捣碎机，离心机。

6.1.2.4可调微量移液器。

6.1.2.5细胞培养瓶、细胞培养板等。

6.1.2.6照蛋灯、开孔器。

6.1.3样品采集与处理

6.1.3.1血液样品采集与处理

取肝素抗凝血5ml,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤血样3次～4次，每次2000r/min离心10min.弃上清液后加入等量BLP,置冰浴中用超声波(40μA、1min)处理，经处理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品置-70℃保存备用。

6.1.3.2组织样品采集与处理

无菌采集动物肾、脾、肝各5g,剪碎后加入乳耕蛋白陈缓冲肉汤(BLF)10mL(含青霉素2000IU/ml…,链霉素2000pg/mL),置乳钵中研磨，置4℃浸泡4h以王，取上清液5mL用超声波裂解(100pA、1min~2min)处理或冻融三次，3000r/min离心20min,取上清液快用，使用前置4℃保存，剩余样品置-70℃保存备用。

6.1.3.3库螺样品采集与处理

取200个～300个库蝶盛于小试管中，加入含青霉素20001U/mL,链霉素2000μg/mL的BLP

3ml~5mL置冰溶中研磨虫体，3000r/min离心20min,取上清液使用，使用前置4℃保存，剩余样

品置-70℃保存备用。

6.1.4鸡胚静脉接种

6.1.4.1开孔：选择10d~11d发育良好的SPF鸡胚，在照蛋灯上标记静脉位置和开孔区，用开孔器

开窗备用。

6.1.4.2接种：在无菌条件下，每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1mL…接种后用溶解的石蜡封口，置33.5℃培养。

6.1.4.3观察：逐日观察并记录，48h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，收取48h后死亡的鸡胚置4℃

SN/T1161—2010

冰箱保存，于接种后第6d同未死亡鸡胚一起收毒。

6.1.4.4收毒：在无菌条件下，用碘酒、酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳膜、尿囊膜、羊膜后，取出胚体，置平皿中，在每个胚体上取若干组织块(有病变时，取病变组织》,置组织捣碎器或研钵中研磨后，按115加入BLP(含青霉素2000IU/mL,链霉素2000μg/mL),置4℃浸提4h.冻融三次，3000r/min离心20min.取上清液当日使用，剩余样品置-70℃保存备用。

6.1.5接种敏感细胞盲传

6.1.5.1按常规方法制备鹿胎肾细胞或BHK-21细胞单层。

6.1.5.2将收获的鸡胚上清液，4℃5000r/min,离心20min。取上清液接种细胞单层，每份病料接种两孔，每孔接种0.1ml.,置37℃培养，培养5d。

6.1.5.3第5天用吸管吹下被接种的鹿胎肾细胞或BHK-21细胞，冻融一次。

6.1.5.4将冻融的细胞悬液接种于已长成单层的鹿胎肾细胞或BHK-21细胞单层，37℃吸附1h后，加入维持液置37℃培养，24h后逐日观察细胞病变(CPE)。连续观察5d。

6.1.6判定

病原接种敏感细胞，盲传2代，无细胞病变，判为病毒分离阴性；出现细胞病变，则需进一步进行鉴定。

6.2病毒鉴定

6.2.1荧光抗体试验

6.2.1.1将接种的鹿胎肾细胞或BHK-21细胞培养物冻融一次，1000r/min离心10min,取上清液接种于带有玻片的24孔细胞培养板的细胞单层。每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，37℃吸附1h后加入维持液，置37℃培养72h。

6.